نيو إنجلاند بيولابس، M0202T، إنزيم ربط الحمض النووي T4

هل تبحث عن تركيبات وأنواع إضافية من إنزيم T4 DNA Ligase؟ الفئات ذات الصلة: تطبيقات إنزيمات ربط الحمض النووي، BioBrick®، التجميع، ربط الاستنساخ، NEBridge® Golden Gate Assembly. المواصفات: تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لتحقيق ربط 50% من قطع HindIII من الحمض النووي λ (بتركيز 0.12 ميكرومولار، 300 ميكروغرام/مل) في حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر خلال 30 دقيقة عند درجة حرارة 16 درجة مئوية في محلول منظم تفاعل إنزيم T4 DNA Ligase بتركيز 1X. التركيز: 400,000 وحدة طرفية متماسكة/مل و2,000,000 وحدة طرفية متماسكة/مل. شروط التفاعل: محلول تفاعل إنزيم ربط الحمض النووي T4 بتركيز 1X، يُحضن عند 16 درجة مئوية. محلول تفاعل إنزيم ربط الحمض النووي T4 بتركيز 1X: 50 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار MgCl2، 1 ملي مولار ATP، 10 ملي مولار DTT (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الأسئلة الشائعة : س: ما هي بعض المشاكل المحتملة في تفاعل الربط باستخدام إنزيم ربط الحمض النووي T4 والتي قد تؤدي إلى فشل التحويل؟ ج: * فشل الربط بسبب عدم وجود ATP أو Mg2+. استخدم المحلول المنظم المرفق أو أضف ATP إلى محلول منظم متوافق. قد يكون ATP الموجود في المحاليل المنظمة التي يزيد عمرها عن عام قد تحلل بدرجة كافية للتسبب في مشاكل. عند إضافة ATP، تأكد من استخدام ريبوز ATP لأن ديوكسي ريبوز ATP لن يعمل. * فشل الربط بسبب ارتفاع نسبة الملح أو EDTA في التفاعل. نظف الحمض النووي. * لم يتم تعطيل CIP أو BAP أو SAP تمامًا من خطوة إزالة الفسفرة. اتبع الإجراء الموصى به لإزالة الفوسفاتاز. * أنتج الربط حمضًا نوويًا خطيًا فقط لأن تركيز الحمض النووي كان مرتفعًا جدًا. حافظ على تركيز الحمض النووي الكلي بين 1-10 ميكروغرام/مل. * كان الطرف المربوط عبارة عن قاعدة واحدة بارزة. استخدم ما يصل إلى 5 ميكرولتر من الليغاز المركز عند 16 درجة مئوية طوال الليل. * لا يحتوي كل من الجزء المُدخل والبلازميد على فوسفات. ملاحظة: قد لا تحتوي البادئات على فوسفات مما يؤدي إلى مشاكل في ربط الأطراف غير المتطابقة في النواقل المُعالجة بـ CIP. اطلب بادئات تحتوي على فوسفات أو عالج البادئات باستخدام الكيناز. * أُضيفت كمية كبيرة جدًا من خليط الربط إلى الخلايا. أضف ما بين 1-5 ميكرولتر إلى 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. * كان حجم القطعة المُدخلة كبيرًا، ولم تسمح الظروف بتكوين حلقة. قلل تركيز القطعة المُدخلة، واستخدم إنزيم الربط المركز عند درجة حرارة 16 درجة مئوية طوال الليل. * كان إنزيم الربط غير نشط. اختبره على لامدا هيند III أو ركيزة أخرى مناسبة. * احتوى خليط الربط على بولي إيثيلين جلايكول (PEG) وتم تحضينه طوال الليل. يؤدي الربط المطول باستخدام PEG إلى انخفاض كفاءة التحويل. قد يكون هذا بسبب الإنتاج التدريجي لقطع خطية كبيرة من الحمض النووي التي يمكن أن تثبط التحويل. يحتوي المحلول المنظم لمجموعة الربط السريع (NEB# M2200) على PEG. * لم يتم تنقية خليط الربط قبل التحويل الكهربائي. يجب إزالة المحلول المنظم وإلا ستتولد شرارة من الملح. قم بغسل العينة بالترشيح الغشائي أو استخدم عمودًا دوارًا للتنقية. يمنع PEG الموجود في محلول مجموعة الربط السريع (NEB# M2200) حدوث الشرارة، ولكنه يمنع أيضًا التحويل الكهربائي. يجب إزالة البولي إيثيلين جلايكول (PEG) باستخدام عمود طرد مركزي. س: ما المشاكل التي قد تواجه عملية الهضم الإنزيمي والتي قد تؤدي إلى فشل الربط باستخدام إنزيم T4 DNA Ligase أو التحويل اللاحق؟ ج: * لم يقم إنزيم القطع بالقطع بكفاءة. إذا كان القطع يحدث قرب نهاية قطعة PCR، اترك 6 قواعد على الأقل بعد موقع القطع. اختبر إنزيم القطع على ركيزة تحكم. * لم يتم تعطيل إنزيم القطع بشكل كامل. قم بتنقية الحمض النووي باستخدام الفينول/الإيثانول إذا تعذر تعطيل الإنزيم بالحرارة. * أدى النشاط الزائد الناتج عن عملية الهضم الإنزيمي إلى قطع الناقل أو القطعة المُدخلة. افحص الحمض النووي على هلام. إذا ظهرت حزمة إضافية، قلل كمية الإنزيم أو مدة عملية الهضم الإنزيمي. * احتوى الحمض النووي أو إنزيم القطع على إكسونوكلياز أو فوسفاتاز أدى إلى تلف الأطراف. قم بتنقية الحمض النووي باستخدام الفينول/الإيثانول. راجع بيانات مراقبة جودة الإنزيم والملاحظات. إذا كانت جودة ربط الحمض النووي ضعيفة أو كان مستوى الإكسونوكلياز مرتفعًا، قلل كمية الإنزيم أو مدة الحضانة. * عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) محمية ببراءات اختراع مملوكة لشركة روش للأنظمة الجزيئية. س: ما هي الضوابط التي يجب إجراؤها لاختبار الخلايا والحمض النووي عند استخدام إنزيم T4 DNA Ligase؟ ج: ملاحظة: استخدم نفس تركيز الحمض النووي لكل ضابط، عادةً 0.1 - 1.0 نانوغرام لكل عملية تحويل. 1. تحويل الناقل غير المقطوع في الخلايا المؤهلة يتحقق من حيوية الخلية ويختبر مقاومة البلازميد للمضادات الحيوية. يُزرع على وسط غذائي ووسط غذائي مضاف إليه مضاد حيوي. 2. اختبار الناقل الخطي للكشف عن الخلفية الناتجة عن البلازميد غير المقطوع. يجب أن تكون النتيجة أقل من 1% من القيمة التي تم الحصول عليها في الخطوة 1. 3. اختبار البلازميد المقطوع والمعاد ربطه يتحقق من نشاط الليغاز وسلامة نهايات الحمض النووي. يجب أن تكون النتيجة قريبة من القيمة التي تم الحصول عليها في الخطوة 1. 4. اختبار البلازميد المقطوع والمُفَسْفَت والمعاد ربطه يكشف عن الخلفية الناتجة عن المعالجة غير الكاملة بالفوسفاتاز. يجب أن تكون القيمة أقل من 1% من القيمة المُحَصَّلة في الخطوة 1. س: متى يُفضَّل استخدام إنزيم T4 DNA Ligase؟ ج: يُستخدم إنزيم T4 DNA Ligase لربط النهايات المتماسكة (10 دقائق في درجة حرارة الغرفة) أو النهايات غير المتماسكة (ساعتان في درجة حرارة الغرفة)، أو إذا كان الربط سيُجرى طوال الليل. كما يُستخدم إنزيم T4 DNA Ligase إذا لزم تعطيله بالحرارة. يُقترح استخدام إنزيم T4 DNA Ligase المُركَّز لربط النهايات ذات القاعدة الواحدة المتدلية، أو للتركيبات الكبيرة التي تتطلب فترات حضانة أطول لتكوينها بشكل دائري، مثل تركيب الكروموسوم الاصطناعي البكتيري (BAC). س: هل يُمكن استخدام إنزيم T4 DNA Ligase مع محلول Quick Ligase؟ ج: نعم، يُمكن استبدال إنزيم T4 DNA Ligase المُركَّز به مباشرةً. عند استخدام إنزيم T4 DNA Ligase العادي، يجب زيادة وقت التفاعل من 5 دقائق إلى 15 دقيقة. لا تُوقف التفاعل بالحرارة لأن معالجة PEG في محلول Quick Ligase بالحرارة ستُثبِّط عملية التحويل. كما ستنخفض كفاءة التحويل إذا تم تمديد وقت التفاعل. س: ما هو تعريف وحدة فايس ووحدة النهاية المتماسكة؟ ج: تعتمد وحدة فايس على تفاعل تبادل ATP-PPi المحفز بواسطة إنزيم T4 DNA ligase، كما وصفه برنارد فايس وتشارلز ريتشاردسون وزملاؤهما (Weiss, B., et. al., (1968) J. Biol. Chem., 243, 4556). تُعرَّف وحدة فايس بأنها كمية الإنزيم اللازمة لتحويل 1 نانومول من بيروفوسفات غير عضوي موسوم بـ 32P إلى مادة نوريت القابلة للامتصاص خلال 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية، باستخدام ظروف تفاعل محددة (Weiss, B., et., (1968) J. Biol. Chem., 243, 4543). نوريت هو نوع من الكربون المنشط. تُعرَّف وحدة النهاية المتماسكة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لتحقيق ربط بنسبة 50% لقطع الحمض النووي لامدا المُعالَجة بواسطة إنزيم Hind III (بتركيز 0.12 ميكرومولار (300 ميكروغرام/مل) في 20 ميكرولتر من محلول T4 DNA Ligase Buffer بتركيز 1X خلال 30 دقيقة عند درجة حرارة 16 درجة مئوية. س: ما الفرق بين التعريفين، ولماذا تستخدم شركة NEB وحدة النهاية المتماسكة؟ ج: وحدة فايس ليست قياسًا مباشرًا لربط الحمض النووي، بل هي قياس غير مباشر لتفاعل الأدينيلَة الإنزيمية، يليه تحديد تبادل ATP-PPi. لم ترَ شركة NEB أن وحدة فايس كافية من حيث المعلومات، لأن الاستخدام الأكثر شيوعًا لإنزيم T4 DNA ligase هو ربط الحمض النووي. ولأن وحدة النهاية المتماسكة تتضمن قياسًا مباشرًا لربط الحمض النووي، ترى شركة NEB أنها أكثر ملاءمة من الناحية العملية. س: ما كمية الحمض النووي (DNA) اللازمة في عملية الربط باستخدام إنزيم T4 DNA Ligase؟ ج: تستخدم الوحدة 0.12 ميكرومول (300 ميكروغرام/مل) من شظايا لامدا HindIII. يمكن استخدام تركيز عالٍ من الحمض النووي لربط الوصلات. ولتعزيز تكوين الدوائر، وهو أمر مفيد في التحويل، يُنصح باستخدام تركيز إجمالي أقل من الحمض النووي. يجب أن يتراوح التركيز الإجمالي للناقل + القطعة المُدخلة بين 1 و10 ميكروغرام/مل لضمان كفاءة الربط. يُوصى بنسب مولية للناقل إلى القطعة المُدخلة تتراوح بين 1:1 و1:10 (1:3 هي النسبة النموذجية). إذا لم تكن متأكدًا من تركيزات الحمض النووي، فقم بإجراء عمليات ربط متعددة بنسب مختلفة. س: هل يمكن استخدام إنزيم T4 DNA Ligase في محاليل NEBuffers الأخرى، بما في ذلك rCutSmart؟ ج: يمكن إجراء عملية الربط في أي من محاليل NEBuffers القياسية لإنزيمات القطع المحددة، بما في ذلك محلول rCutSmart®، أو في محلول T4 Polynucleotide Kinase Buffer مع إضافة 1 ملي مول من ATP. يُرجى التأكد من استخدام riboATP (NEB #P0756) لأن deoxyriboATP لن يُجدي نفعًا. عند استخدام NEBuffer 3 أو r3.1، قد تؤدي المستويات العالية من الملح في تحضير الحمض النووي إلى انخفاض كفاءة الربط. لمعرفة النسبة المئوية لنشاطه الوظيفي في rCutSmart، ونشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي الأخرى في عملية الاستنساخ، يُرجى الرجوع إلى مخطط نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي في محلول rCutSmart®. س: هل يمكن تعطيل إنزيم T4 DNA Ligase بالحرارة؟ ج: نعم، سخّنه عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. لا تُعطّله بالحرارة إذا كان محلول التفاعل (محلول Quick Ligation Kit NEB# M2200) يحتوي على PEG، لأن ذلك سيمنع عملية التحويل.