نيو إنجلاند بيولابس، M0204L، T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)

يتوفر أيضًا إصدار عالي التركيز (30,000 وحدة/مل) من هذا الإنزيم، وهو T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)، عالي التركيز ( الفئات ذات الصلة : تطبيقات ربط الحمض النووي الريبي، استنساخ الحمض النووي الريبي، المواصفات، المواد المطلوبة ولكن غير المرفقة: ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500)، مثبط RNase، فأري (NEB #M0314) (اختياري). تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لتحويل 1 نانومول من rA16 الموسوم بالفلورسنت إلى شكل مقاوم للفوسفاتاز في 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل T4 RNA Ligase بتركيز 1X، مضاف إليه 1 ملي مول من ATP، يُحضن عند 25 درجة مئوية. محلول تفاعل T4 RNA Ligase بتركيز 1X، 50 ملي مول من Tris-HCl، 10 ملي مول من MgCl2، 1 ملي مول من DTT (الأس الهيدروجيني 7.5 عند (25 درجة مئوية) محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، درجة الحموضة 7.4 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري : 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. شروط فحص الوحدة : يُخلط محلول تفاعل T4 RNA Ligase بتركيز 1X، مُضافًا إليه 1 ملي مولار ATP، مع ركيزة RNA (10 ميكرومولار من rA16 المُوسَم بالفلورسنت) وكميات متفاوتة من الإنزيم. تتم الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (8). التركيز: 10000 وحدة/مل. الأسئلة الشائعة : س: ما هي درجة حرارة ووقت التفاعل الأمثل لإنزيم T4 RNA Ligase I؟ ج: بشكل عام، يؤدي زيادة وقت التفاعل وخفض درجة حرارة التفاعل إلى تفاعلات ربط أكثر اكتمالًا. يجب إجراء تفاعل الربط النموذجي عند 25 درجة مئوية لمدة تصل إلى ساعتين. بالنسبة للأوليغومرات الأطول، ساعتان قد يؤدي الحضانة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية متبوعةً بحضانة ليلية عند درجة حرارة 16 درجة مئوية إلى تحسين المردود. س: هل يمكن استخدام إنزيم T4 RNA Ligase 1 لوسم نهايات الحمض النووي أحادي السلسلة (DNA) أو الحمض النووي الريبي (RNA)؟ ج: يمكن استخدام إنزيم T4 RNA Ligase 1 لوسم النهاية 3' للحمض النووي الريبي أحادي السلسلة (ssRNA). ويمكن استخدام إنزيم Terminal Transferase (#M0315) لوسم النهاية 3' للحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA). ويمكن استخدام إنزيم T4 PNK (#M0201) لوسم النهاية 5' للحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA). س: هل يقوم إنزيم T4 RNA Ligase 1 بربط الحمض النووي ثنائي السلسلة (DNA)؟ ج: لا، ليس بشكل ملحوظ. على عكس التقارير السابقة، لا يُحسّن إنزيم T4 RNA Ligase 1 ربط النهايات غير المتداخلة بشكل ملحوظ عند استخدامه مع إنزيم T4 DNA Ligase 1. (1). (1) Sugino, A. et al. (1977) J. Biol. Chem. 252, 3987-3994. س: ما هو س: ما هو السبب الأكثر شيوعًا لفشل الربط عند استخدام إنزيم T4 RNA Ligase 1؟ ج: قد يؤدي وجود بنية ثانوية للحمض النووي الريبي (RNA) تحجب الأطراف إلى تثبيط عملية الربط. ويمكن زيادة الربط في هذه الحالات بإضافة DMSO بنسبة 10% (حجم/حجم). س: لماذا لا يحتوي محلول تفاعل إنزيم T4 RNA Ligase الجديد على ATP؟ ج: لتوفير مرونة أكبر للعملاء في استخدام هذا المنتج، نوفر الآن محاليل ATP بتركيز 10 ملي مولار وPEG8000 بنسبة 50% كمكونات منفصلة عن محلول الإنزيم. كما أن محلول تفاعل إنزيم T4 RNA Ligase (NEB #B0216) متوافق أيضًا مع إنزيم T4 RNA Ligase 2، المختزل (NEB #M0242) وإنزيم T4 RNA Ligase 2، المختزل K227Q (NEB #M0351). س: هل سينتج عن تفاعل الربط باستخدام إنزيم T4 RNA Ligase 1 حلقات أم منتجات مزدوجة؟ ج: يمكن أن ينتج عن التفاعل كلا النوعين. وتُعرَّف الوحدة بإنتاج حلقات باستخدام يُستخدم rA-20mer كركيزة. يمكن زيادة عدد عمليات الربط بين الجزيئات عن طريق زيادة التركيز والطول وإضافة البولي إيثيلين جلايكول (PEG). يمنع حجب أحد طرفي الجزيء باستخدام مُنهي ثنائي الديوكسي الجزيء من تكوين حلقة. س: هل يمكن استخدام إنزيم T4 RNA Ligase 1 لصنع هجائن RNA/DNA أحادية السلسلة؟ ج: نعم. س: هل يمكن لإنزيم T4 RNA Ligase 1 ربط ثلاثي الفوسفات؟ ج: لا. مع ذلك، يمكن معالجة الحمض النووي الريبي (RNA) أولًا باستخدام CIP لإزالة ثلاثي الفوسفات، ثم باستخدام كيناز لإضافة فوسفات واحد. يمكن ربط الشظايا التي تحتوي على هذه الفوسفاتات الأحادية 5' بواسطة إنزيم T4 RNA Ligase 1. س: هل يمكن استخدام إنزيم T4 RNA Ligase 1 لإضافة ذيول إلى الحمض النووي المزدوج الخطي؟ ج: نعم، يمكن ربط قليل النوكليوتيدات من الحمض النووي الريبي (RNA) بالحمض النووي المزدوج ذي النهايات غير المتداخلة أو المتماسكة. يتم ربط قليل النوكليوتيدات من الحمض النووي (DNA) بمعدل منخفض للغاية (3). (3) هيغينز، إن بي وآخرون (1979) NAR 6، ص 1013-1024. س: هل يمكن استخدام ثنائي ديوكسي لمنع الربط باستخدام T4 RNA Ligase 1؟ ج: نعم (2). (2) تروت، إيه بي وآخرون (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89، ص 9823-9825. س: هل يمكن استخدام T4 RNA Ligase 1 لإدخال الأحماض الأمينية غير الطبيعية في البروتينات؟ ج: نعم، انظر المرجع نورين، سي جيه وآخرون (1989) Science 244، 182-188. س: هل يُحسّن البولي إيثيلين جلايكول (PEG) الربط مع T4 RNA Ligase 1؟ ج: نعم (4)، يمكن استخدام محلول Quick Ligation Kit buffer (NEB# M2200) مع T4 RNA Ligase 1. (4) هاريسون، بي، وزيمرمان، إس بي، (1984) NAR 12، 8235-8251. س: هل يقوم إنزيم T4 RNA Ligase 1 بربط الحمض النووي أحادي السلسلة؟ ج: نعم. التفاعل أبطأ من تفاعل RNA/RNA أو RNA/DNA. على سبيل المثال، يمكن ربط البادئات بالحمض النووي المكمل (cDNA) (2). (2) Troutt, AB, et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89. ص 9823-9825. س: هل PEG 8000 متوفر للشراء؟ ج: PEG 8000 مُضمن كمكون في محلول تفاعل T4 RNA Ligase (NEB #B0216). س: ما مدى تحمل هذا الإنزيم للملح؟ ج: NEB # RNA Ligase Salt Tolerance M0204 T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) ≤ 50 mM M0239 T4 إنزيم ربط الحمض النووي الريبوزي 2 (إنزيم ربط الحمض النووي الريبوزي المزدوج) ≤ 50 ملي مولار M0242، إنزيم ربط الحمض النووي الريبوزي 2، مُقَطَّع ≤ 100 ملي مولار M0351، إنزيم ربط الحمض النووي الريبوزي 2، مُقَطَّع K277Q ≤ 100 ملي مولار M0373، إنزيم ربط الحمض النووي الريبوزي 2، مُقَطَّع KQ ≤ 100 ملي مولار M0375، إنزيم ربط SplintR ≤ 50 ملي مولار E2610، مجموعة أدينيلية 5' (إنزيم ربط Mth) ≤ 300 ملي مولار M0319، إنزيم ربط الحمض النووي/الحمض النووي الريبوزي 5' المقاوم للحرارة ≤ 50 ملي مولار