نيو إنجلاند بيولابس، M0205S، إنزيم ربط الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية

سيقوم إنزيم ربط الحمض النووي بربط هذه الركائز: الفئات ذات الصلة تطبيقات إنزيمات ربط الحمض النووي مواصفات الربط غير المستنسخ تعريف الوحدة تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لإعطاء ربط بنسبة 50٪ لقطع HindIII من الحمض النووي λ (تركيز نهايات الحمض النووي 5' هو 0.12 ميكرومتر، 300 ميكروغرام/مل) في حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر في 30 دقيقة عند 16 درجة مئوية في محلول تفاعل إنزيم ربط الحمض النووي E. coli 1X. شروط التفاعل: محلول تفاعل إنزيم ربط الحمض النووي E. coli بتركيز 1X، يُحضن عند درجة حرارة 16 درجة مئوية. محلول تفاعل إنزيم ربط الحمض النووي E. coli بتركيز 1X: 30 ملي مولار Tris-HCl، 4 ملي مولار MgCl2، 26 ميكرومولار NAD، 1 ملي مولار DTT، 50 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 8 عند 25 درجة مئوية). تركيز الاستخدام: 10000 وحدة/مل. محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 200 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين إنزيم ربط الحمض النووي E. coli (NEB# M0205) وإنزيم ربط الحمض النووي T4 (NEB# M0202)؟ ج: في ظل الظروف الموصى بها، لن يقوم إنزيم ربط الحمض النووي E. coli DNA Ligase بربط النهايات غير المتداخلة ولا الحمض النووي DNA بالحمض النووي الريبي RNA. يتميز إنزيم ربط الحمض النووي E. coli DNA Ligase بأنه أكثر تخصصًا في ربط النهايات المتماسكة من إنزيم ربط الحمض النووي T4 DNA Ligase. س: أي إنزيم ربط يجب أن أستخدم؟ ج: يُنصح باستخدام مجموعة الربط السريع (NEB #M2200) إذا كان الوقت عاملاً مهمًا، خاصةً إذا كان الربط يتضمن نهايات غير متداخلة (5 دقائق في درجة حرارة الغرفة). يُعد إنزيم ربط الحمض النووي T4 DNA Ligase (NEB #M0202) الإنزيم المفضل لمعظم تطبيقات الحمض النووي المؤتلف. يمكن استخدامه للنهايات المتماسكة (10 دقائق في درجة حرارة الغرفة) والنهايات غير المتداخلة (ساعتان في درجة حرارة الغرفة)، أو إذا كان الربط سيُجرى طوال الليل. قد تنخفض كفاءة التحويل إذا تم استخدام مجموعة الربط السريع طوال الليل. استخدم إنزيم ربط الحمض النووي T4 DNA Ligase إذا كانت هناك حاجة إلى تعطيل الإنزيم بالحرارة. يلزم استخدام عمود طرد مركزي لإزالة البولي إيثيلين جلايكول (PEG) من مجموعة الربط السريع قبل التحويل الكهربائي. يُقترح استخدام إنزيم ربط مركز لربط النهايات المتدلية أحادية القاعدة. تستفيد التركيبات الكبيرة، مثل الكروموسومات البكتيرية الاصطناعية (BACs)، التي تتطلب فترات حضانة أطول لتكوينها الدائري، من استخدام الليغاز بتركيز عالٍ. استخدم ليغاز الحمض النووي من الإشريكية القولونية (NEB #M0205) إذا كنت ترغب في ربط النهايات المتماسكة مع تثبيط ربط النهايات غير المتماسكة أو الربط بالحمض النووي الريبي (RNA). يتميز ليغاز الحمض النووي من الإشريكية القولونية بتخصصه العالي للنهايات المتماسكة مقارنةً بليغاز الحمض النووي T4. استخدم ليغاز الحمض النووي الريبي T4 (NEB# M0204) إذا كان الهدف هو ربط الحمض النووي أحادي السلسلة أو الحمض النووي الريبي. سؤال: هل يعمل ليغاز الحمض النووي من الإشريكية القولونية في محلول rCutSmart؟ جواب: نعم، يعمل ليغاز الحمض النووي من الإشريكية القولونية في محلول rCutSmart، مع إضافة NAD. لمعرفة نسبة نشاطه الوظيفي في rCutSmart، ونسبة نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي الأخرى في عملية الاستنساخ، راجع مخطط نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي في محلول rCutSmart®.