نيو إنجلاند بيولابس، M0207S، بوليميراز الحمض النووي الريبي SP6

يُستخدم بوليميراز الحمض النووي الريبي SP6 في الفئات ذات الصلة : تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) والنسخ العكسي، وتخليق الحمض النووي الريبي (RNA) والنسخ في المختبر (IVT)، ومحاليل النيوكليوتيدات لتطبيقات الحمض النووي الريبي (RNA). مواصفات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) . المواد المطلوبة ولكنها غير متوفرة : مثبط إنزيم RNase، فأري (NEB #M0314) (اختياري)، مزيج محلول الريبونوكليوتيدات (NEB #N0466)، DTT طازج (اختياري)، ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500). تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لدمج 1 نانومول من ATP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض خلال ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل RNAPol بتركيز 1X، مُضاف إليه 0.5 ملي مولار من كل من ATP وGTP وUTP وCTP، ويُحضن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. محلول تفاعل RNAPol بتركيز 1X: 40 ملي مولار Tris-HCl، 6 ملي مولار MgCl2، 1 ملي مولار DTT، 2 ملي مولار سبيرميدين (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 50 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار NaCl، 20 ملي مولار β-ME، 1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، 0.1% (وزن/حجم) Triton® X-100، الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية. شروط فحص الوحدة: محلول تفاعل RNAPol بتركيز 1X، مُضاف إليه 0.5 ملي مولار من كل من ATP وUTP وGTP وCTP، و1 ميكروغرام من الحمض النووي DNA الذي يحتوي على SP6 المحفز في 50 ميكرولتر. الأسئلة الشائعة : س: هل يتطلب تفاعل النسخ باستخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي SP6 بادئًا؟ ج: لا، يتعرف بوليميراز الحمض النووي الريبي SP6 على تسلسل المحفز الخاص به ويبدأ النسخ عند آخر قاعدة غوانين (G). ثم يقوم البوليميراز بالنسخ باستخدام الشريط المقابل كقالب من 5' إلى 3'. س: هل يترك بوليميراز الحمض النووي الريبي SP6 قاعدة إضافية في نهاية النسخة؟ ج: نعم، يمكن لبوليميراز الحمض النووي الريبي SP6 إضافة قاعدة واحدة أو بضع قواعد إضافية في نهاية النسخة، مما ينتج عنه مجموعة من النسخ ذات نهايات 3' غير متجانسة. س: هل يعمل بوليميراز الحمض النووي الريبي SP6 على ركيزة أحادية الشريط؟ ج: لا، يجب أن تكون منطقة تسلسل المحفز مزدوجة الشريط. س: هل يعمل بوليميراز الحمض النووي الريبي SP6 على الحمض النووي البلازميدي غير المقطوع؟ ج: نعم، ولكن بوليميراز الحمض النووي الريبي SP6 هو إنزيم شديد المعالجة وسيستمر في النسخ حول قالب دائري عدة مرات دون أن ينفصل. يمكن تحويل البلازميد إلى شكل خطي باستخدام إنزيم تقييد يترك طرفًا غير لاصق أو امتدادًا 5' أسفل الحمض النووي المستهدف. س: هل يمكن إنتاج حمض نووي ريبوزي شاذ عند استخدام بوليميراز الحمض النووي الريبوزي SP6؟ ج: لوحظ إنتاج حمض نووي ريبوزي شاذ عندما ينتج عن إنزيم التقييد المستخدم لتحويل البلازميد إلى شكل خطي امتدادًا 3'. لتجنب ذلك، يجب قطع البلازميد باستخدام إنزيم تقييد يترك طرفًا غير لاصق أو امتدادًا 5' أسفل الحمض النووي المستهدف. س: هل يمكنني استخدام بوليميراز الحمض النووي الريبوزي SP6 لصنع مجسات موسومة إشعاعيًا ذات نشاط نوعي عالٍ؟ ج: نعم، يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي الريبوزي T7، وبوليميراز الحمض النووي الريبوزي SP6، وبوليميراز الحمض النووي الريبوزي T3، ومجموعة HiScribe T7 (NEB #E2040) لصنع مجسات الحمض النووي الريبوزي. يمكن الحصول على حساسية كشف أعلى للأحماض النووية باستخدام مسبار RNA نظرًا لاستقرار هجائن RNA/DNA بشكل أكبر من هجائن DNA/DNA. س: لماذا النشاط النوعي للمسبار منخفض؟ ج: يجب أن يكون تركيز النيوكليوتيد المشع محدودًا (6 ميكرومول). بمعنى آخر، عند استخدام ATP موسوم، أضف 500 ميكرومول من UTP وCTP وGTP، ولكن 6 ميكرومول فقط من ATP في عملية النسخ، بحيث يتم دمج ATP بنسبة أعلى، مما ينتج عنه مسبار RNA نشط للغاية. س: ما هي الأسباب الرئيسية لفشل التفاعل باستخدام بوليميراز RNA SP6؟ ج: بوليميراز RNA SP6 حساس للغاية لتثبيط الأملاح. يجب ألا يتجاوز تركيز الملح أحادي التكافؤ 20 ملي مول. يجب تحضير قالب DNA خاليًا من الأملاح. يؤدي تلوث RNase إلى تحلل منتج RNA. نوصي باستخدام مثبط RNase (NEB #0314 أو #M0307) في التفاعل بتركيز وحدة واحدة/ميكرولتر. استخدم الماء فائق النقاء وتأكد من استخلاص قالب الحمض النووي باستخدام الفينول/الكلوروفورم.