نيو إنجلاند بيولابس، M0208S، إنزيم ربط الحمض النووي Taq

تمت إعادة صياغة إنزيم ربط الحمض النووي باستخدام الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10233580. الفئات ذات الصلة: إنزيمات ربط الحمض النووي، التطبيقات: تجميع جيبسون، الاستنساخ، مواصفات الربط، تعريف الوحدة (وحدة النهاية المتماسكة): تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لتحقيق ربط بنسبة 50% للأطراف المتماسكة المكونة من 12 زوجًا قاعديًا لـ 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ المهضوم بواسطة BstEII في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر في 15 دقيقة عند 45 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل إنزيم ربط الحمض النووي Taq بتركيز 1X، يُحضن عند درجة حرارة 45 درجة مئوية. محلول تفاعل إنزيم ربط الحمض النووي Taq بتركيز 1X، 20 ملي مولار Tris-HCl، 25 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 1 ملي مولار NAD، 10 ملي مولار DTT، 0.1% Triton® X-100 (الأس الهيدروجيني 7.3 عند 25 درجة مئوية). تركيز الاستخدام: 40,000 وحدة/مل. محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 200 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: لا يوجد. شروط فحص الوحدة: محلول تفاعل إنزيم ربط الحمض النووي Taq بتركيز 1X وحمض نووي (20 ميكروغرام/مل). بعد التحضين عند 45 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، يُوقف التفاعل بإضافة صبغة الإيقاف (50% جلسرين، 50 ملي مولار EDTA، وأزرق بروموفينول)، ثم يُسخن عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ويُحمل بعد ذلك على هلام أجاروز بنسبة 0.7%. بفضل وجود الليغاز، تبقى نهايات cos لـ DNA λ المُهضّم بواسطة BstEII متصلة بعد المعالجة الحرارية عند 70 درجة مئوية. الأسئلة الشائعة : س: هل يُستخدم ليغاز Taq DNA في تقنية خاصة؟ ج: نعم. يُستخدم في تفاعل سلسلة الليغاز (LCR) وتفاعل الكشف بالليغاز (LDR). بشكل عام، يمكن الكشف عن تغيير قاعدة واحدة بواسطة مجسين يلتقيان، حيث تتزاوج القاعدة الطرفية لأحد المجسين مع القاعدة المراد تحليلها. إذا تزاوجت القاعدة الطرفية مع القالب، يستطيع الليغاز ربط المجسين. أما إذا لم تتزاوج القاعدة الطرفية، فلن يقوم الليغاز بربط المجسين. بما أن الليغاز مقاوم للحرارة، يمكن تكرار التفاعل وتضخيم نواتج الربط. س: ما مقدار الربط الذي يحدث عند عدم التطابق عند استخدام إنزيم Taq DNA Ligase؟ ج: الحد الأقصى للربط عند عدم التطابق هو 1.3%. س: كم عدد دورات درجة الحرارة التي يتحملها إنزيم Taq DNA Ligase؟ ج: 30 دورة على الأقل. س: هل يمكن استخدام إنزيم Taq DNA Ligase للاستنساخ؟ ج: لا يربط إنزيم Taq DNA Ligase جميع أنواع النهايات. نوصي باستخدام إنزيم T4 DNA Ligase (NEB# M0202) للاستنساخ. س: ما الوزن الجزيئي لإنزيم Taq DNA Ligase؟ ج: يبلغ وزن الشكل المؤدينيل 77.2 كيلو دالتون، بينما يبلغ وزن الشكل غير المؤدينيل 76.9 كيلو دالتون. س: لماذا يكون لون محلول إنزيم Taq DNA Ligase بنيًا؟ ج: يتفاعل كل من DTT وNAD ويتحول لونهما إلى البني إذا تم تخزين المحلول في درجات حرارة أعلى من -70 درجة مئوية. لا يؤثر تغير اللون البني على نشاط الإنزيم. س: هل يتطلب إنزيم Taq DNA Ligase وجود NAD؟ ج: نعم. يرتبط الإنزيم بكمية كافية من NAD، لذا سيعمل إلى حد ما في المحاليل المنظمة التي لا تحتوي على NAD. س: ما هو نشاط إنزيم Taq DNA Ligase في محاليل NEBuffer الأخرى؟ ج: نشاط إنزيم Taq DNA Ligase في المحاليل المنظمة الأخرى كما يلي: NEBuffer™ r2.1: 10,000 وحدة/مل، NEBuffer™ r3.1: 8-10,000 وحدة/مل، rCutSmart™ Buffer: 12-16,000 وحدة/مل. يتم الحصول على النشاط الكامل باستخدام محلول Taq DNA Ligase Buffer الخاص، المرفق مع الإنزيم: 40,000 وحدة/مل. س: ما هو نشاط إنزيم Taq DNA Ligase عند درجات حرارة مختلفة؟ ج: 4 درجات مئوية: 2000 وحدة/مل، 16 درجة مئوية: 8-10000 وحدة/مل، 25 درجة مئوية: 12000 وحدة/مل، 37 درجة مئوية: 20000 وحدة/مل، 45 درجة مئوية: 40000 وحدة/مل، 55 درجة مئوية: 40000 وحدة/مل، 65 درجة مئوية: 64000 وحدة/مل، 75 درجة مئوية: 10000 وحدة/مل، 85 درجة مئوية: 3-4000 وحدة/مل، 95 درجة مئوية: أقل من 500 وحدة/مل. س: ما مدى استقرار إنزيم Taq DNA Ligase عند درجة حرارة 95 درجة مئوية؟ ج: 0 دقيقة: 64,000 وحدة/مل، 1 دقيقة: 40-50,000 وحدة/مل، 5 دقائق: 40-50,000 وحدة/مل، 10 دقائق: 32,000 وحدة/مل، 15 دقيقة: 32,000 وحدة/مل، 20 دقيقة: 32,000 وحدة/مل، 30 دقيقة: 32,000 وحدة/مل، 45 دقيقة: 16,000 وحدة/مل، 60 دقيقة: 16,000 وحدة/مل. س: ما مدى ثبات إنزيم Taq DNA Ligase في درجة حرارة الغرفة؟ ج: لأكثر من أسبوع. س: ما هو تفاعل ربط السلسلة (LCR) وما هي الإنزيمات التي توصون بها؟ ج: تفاعل ربط السلسلة (LCR) هو طريقة مشابهة لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم الحمض النووي ولها تطبيقات تشخيصية واعدة. يعتمد تفاعل ربط السلسلة على الربط، ويمكنه التمييز بين تسلسلات الحمض النووي التي تختلف في نيوكليوتيد واحد فقط (تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة). تُستخدم أربعة مجسات في تفاعل ربط الحمض النووي المتسلسل (LCR)، زوج واحد مكمل لكل سلسلة في التسلسل المستهدف، مع وجود نقطة الربط عند تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP) المراد تمييزها. تستخدم هذه الطريقة إنزيمات ربط الحمض النووي المقاومة للحرارة، مثل إنزيم Taq DNA Ligase (NEB #M0208) وإنزيم 9°N™ DNA Ligase (NEB #M0238). لمزيد من المعلومات حول خصوصية إنزيمات الربط وإنزيمات الربط عالية الدقة، يُرجى زيارة "خصوصية الركيزة والتمييز بين عدم التطابق في إنزيمات ربط الحمض النووي". س: ما هو تفاعل الكشف عن الربط (LDR) وكيف يختلف عن تفاعل ربط الحمض النووي المتسلسل (LCR)؟ ج: تفاعل الكشف عن الربط (LDR) هو منهجية تعتمد على الربط، وعلى عكس تفاعل ربط الحمض النووي المتسلسل (LCR)، فإنه يتضمن زوجًا واحدًا فقط من المجسات المكملة لسلسلة واحدة من الحمض النووي المستهدف. ينتج عن تكرار تفاعل الكشف عن الربط (LDR) تضخيم خطي لناتج الربط. يمكن استخدام هذه الطريقة لتأكيد وجود تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP) معين في تسلسل مستهدف تم تضخيمه بطريقة أخرى (مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل PCR). كما هو الحال مع تفاعل ربط الليغاز المتسلسل (LCR)، تستخدم هذه الطريقة إنزيم ربط عالي الدقة ومستقر حراريًا، قادر على التمييز ضد ربط المجسات غير المتطابقة، مثل إنزيم ربط الحمض النووي Taq (NEB #M0208) وإنزيم ربط الحمض النووي 9°N™ (NEB #M0238). لمزيد من المعلومات حول خصوصية إنزيم الربط وإنزيمات الربط عالية الدقة، يُرجى زيارة "خصوصية الركيزة والتمييز بين عدم التطابق في إنزيمات ربط الحمض النووي". س: كيف يُمكنني تصميم مجسات لتفاعل الكشف عن الليغاز (LDR) أو تفاعل ربط الليغاز المتسلسل (LCR) لزيادة الخصوصية إلى أقصى حد؟ ج: يجب تصميم مجسات تفاعل الكشف عن الليغاز (LDR) وتفاعل ربط الليغاز المتسلسل (LCR) بحيث تتحد جميعها ضمن نطاق حراري ضيق (مثاليًا أقل من 2 درجة مئوية)، ويجب أن تحتوي على مناطق اندماج يتراوح طولها بين 15 و30 قاعدة. عادةً، تكون درجة حرارة التفاعل المثلى للحصول على أعلى دقة تقريبًا بين درجتين مئويتين أقل ودرجتين مئويتين أعلى من درجة انصهار الليغاز (Tm) لمجموعة مجسات معينة، ويتم حسابها وفقًا لظروف المحلول المنظم المستخدم. يُنصح بشدة باستخدام حاسبة درجة حرارة تفاعل الليغاز المقاوم للحرارة لاختيار درجة حرارة الحضانة. مع ذلك، يجب تحديد درجة حرارة التفاعل المثلى لمجموعة مجسات معينة تجريبيًا. عند استخدام إنزيم HiFi Taq DNA Ligase، يمكن أن يرتبط النيوكليوتيد المفرد المتغير (SNP) المراد تمييزه إما بالقاعدة 3' للمجس العلوي (موفرًا مجموعة الهيدروكسيل 3' لوصلة الربط) أو بالقاعدة 5' للمجس السفلي (موفرًا مجموعة الفوسفات 5' لوصلة الربط)، حيث يُظهر إنزيم HiFi Taq DNA Ligase تمييزًا مُحسَّنًا بين أزواج القواعد الصحيحة وغير الصحيحة على جانبي وصلة الربط. يُرجى الاطلاع على معلومات المنتج المرفقة لتحليل مُفصَّل لدقة ربط عدم التطابق بواسطة إنزيم HiFi Taq DNA Ligase، والذي يُوضح دقته العالية على جانبي وصلة الربط 3' و5'، بالإضافة إلى نسب تمييز أزواج القواعد المُحددة. للحصول على مزيد من المعلومات حول خصوصية الليغازات وليغازات الدقة العالية، يُرجى زيارة "خصوصية الركيزة والتمييز بين عدم التطابق في ليغازات الحمض النووي". سؤال: هل تقوم ليغازات الحمض النووي المقاومة للحرارة (مثل Taq DNA Ligase و9°N DNA Ligase وHiFi Taq DNA Ligase) بربط النهايات اللزجة؟ جواب: على الرغم من قدرة هذه الليغازات المقاومة للحرارة على ربط النهايات اللزجة ذات التداخل الواسع، مثل النهايات المتماسكة ذات 12 زوجًا قاعديًا في جينوم العاثية لامدا، إلا أن النهايات البارزة النموذجية ذات 4 أزواج قاعدية الناتجة عن إنزيمات التقييد من النوع الثاني لا تُعد ركائز جيدة ولن يتم ربطها. لا يُنصح باستخدام ليغازات الحمض النووي المقاومة للحرارة في عمليات الاستنساخ التقليدية.