نيو إنجلاند بيولابس، M0210S، بوليميراز الحمض النووي الأول، الجزء الكبير (كلينو)

تم اشتقاق جزء DNA Polymerase I الكبير (Klenow) في الأصل كمنتج بروتيني من الفئات ذات الصلة تطبيقات معالجة الحمض النووي، وتثبيط الأطراف، وتسلسل الحمض النووي، وبوليميرازات معالجة الحمض النووي، وتعريف وحدة المواصفات : تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي ستدمج 10 نانومول من dNTP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض في 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. شروط التفاعل: حضانة عند 25 درجة مئوية باستخدام محلول NEBuffer™ 2 بتركيز 1X. محلول التخزين: 25 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار MgCl2، 1 ملي مولار DTT (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 25 ملي مولار Tris-HCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري : 75 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. الوزن الجزيئي النظري: 68000 دالتون. إكسونوكلياز 5' - 3': لا. إكسونوكلياز 3' - 5': نعم. إزاحة السلسلة +. شروط فحص الوحدة: محلول NEBuffer™ 2 بتركيز 1X، 33 ميكرومولار dNTPs بما في ذلك [3H]-dTTP و70 ميكروغرام/مل من الحمض النووي لحيوانات منوية الرنجة المنزوعة الطبيعة. معدل الخطأ ~ 18 × 10⁻⁶ قاعدة. الأسئلة الشائعة : س: ما هو إنزيم بوليميراز الحمض النووي الذي يمكنني استخدامه لتعديل نهايات الحمض النووي؟ ج: ملاحظة: يجب إضافة النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs) إلى تفاعلات التعديل. نوصي بشكل أساسي باستخدام إنزيم بوليميراز الحمض النووي الأول، الجزء الكبير (كلينو) (M0210) للتعديل. يكون النشاط الأمثل للتعديل عند درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). يمكن أيضًا استخدام إنزيم بوليميراز الحمض النووي T4 (M0203) للتعديل، ولكن يجب استخدامه عند 12 درجة مئوية لمنع تكوّن النهايات المتراجعة نظرًا لنشاطه القوي جدًا كإنزيم إكسونيوكلياز 3'-5'. للتعديل في درجات الحرارة المحبة للحرارة، نوصي باستخدام إنزيم بوليميراز الحمض النووي Vent (M0254) أو Deep Vent (M0258). في حين أنه يمكن أيضًا استخدام إنزيم بوليميراز Q5 عالي الدقة للتعديل في درجات الحرارة المحبة للحرارة، إلا أنه يتطلب ظروفًا صارمة جدًا للتخزين للحصول على النشاط الأمثل، ويجب استخدامه فقط مع محلول التفاعل Q5. إنزيم نوكلياز فول المونج (M0250) هو الإنزيم الوحيد في كتالوجنا القادر على إزالة النهايات المتدلية 5'. لتعطيله، نوصي بالتسخين مع إضافة EDTA؛ انقر هنا للاطلاع على إرشادات التعطيل. تُستخدم بوليميرازات الحمض النووي غالبًا لتعديل النهايات المتدلية عن طريق ملء النهايات 5' البارزة (نشاط بلمرة 5' → 3') و/أو إزالة النهايات المتدلية 3' (نشاط إكسونوكلياز 3' → 5'). في غياب النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs)، سيتغلب نشاط الإكسونوكلياز 3'-5' على نشاط البوليميراز 5'-3'، مما يؤدي إلى إزالة عدد أكبر من النيوكليوتيدات من المطلوب. مع ذلك، يُفضل الإنزيم نشاط البلمرة 5'-3' على نشاط الإكسونوكلياز 3'-5' في وجود النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs). يضمن وجود النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs) إعادة ملء النيوكليوتيدات من الجهة المقابلة للقالب، مما ينتج عنه نهايات غير متدلية. للمزيد من المعلومات، يُرجى الاطلاع على الأسئلة الشائعة الأخرى: ما معنى نشاط الإكسونوكلياز بالنسبة لبوليميراز الحمض النووي؟ ما هي نهايات نواتج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)؟ س: هل يُمكنني استخدام بوليميراز الحمض النووي لملء النهايات المتدلية 3' أو إزالة النهايات المتدلية 5'؟ ج: لا، لا يُمكن لبوليميراز الحمض النووي ملء النهايات المتدلية 3' لأنه يُضيف النيوكليوتيدات فقط في الاتجاه 5'-3'. لإزالة النهايات المتدلية 3'، يُرجى الاطلاع على الأسئلة الشائعة حول إزالة النهايات المتدلية. لا، لا يُمكن لبوليميراز الحمض النووي إزالة النهايات المتدلية 5'. إنزيم نوكلياز الفاصوليا الخضراء (M0250) هو الإنزيم الوحيد المُدرج في الكتالوج القادر على إزالة النهايات المتدلية 5'. س: كيف يُمكنني تعطيل بوليميراز الحمض النووي هذا بالحرارة؟ أ: بالنسبة لبوليميراز الحمض النووي الأول (M0209)، وجزء كلينو الكبير (M0210)، وبوليميراز الحمض النووي T4 (M0203)، وبوليميراز الحمض النووي T7 (M0274): لمنع تكوّن نهايات متراجعة (بعد نقطة التضاؤل ​​المطلوبة)، سخّن حمامًا مائيًا أو جهاز تدوير حراري إلى 75 درجة مئوية. قبل وضع العينة عند 75 درجة مئوية، أضف EDTA إلى عينتك بتركيز نهائي 10 ملي مولار (لربط العامل المساعد Mg2+)، ثم حضّنها عند 75 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. لاحظ أن درجات الحرارة المرتفعة، أو الكميات الزائدة من الإنزيم، أو عدم إضافة dNTPs، أو أوقات التفاعل الطويلة ستؤدي إلى نهايات متراجعة بسبب نشاط الإكسونوكلياز 3' → 5' للإنزيم. جزء كلينو (3'→5' exo-): عطّله بالتسخين عند 75 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. لا حاجة إلى EDTA لعدم وجود نشاط إكسونوكلياز 3'-5'. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي هذا في تفاعلات الوسم والتعبئة الجزئية؟ ج: للحصول على تغطية كاملة الطول مع وسم متساوٍ، يُفضل استخدام بوليميراز الحمض النووي I (الإشريكية القولونية) (M0209). عند درجات حرارة تفاعل مرتفعة، يمكن أيضًا استخدام بوليميراز الحمض النووي Taq. لإنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي المزدوج القصير والمجزأ (~250 زوجًا قاعديًا)، يُوصى باستخدام جزء كلينو (إكسونوكلياز 3'→5') (M0212). ترجمة الشق: عند استخدام ترجمة الشق لإنتاج المجسات، يُستخدم عادةً إنزيم DNase I لعمل شق في الحمض النووي. يقوم بوليميراز الحمض النووي I (الإشريكية القولونية) بإزالة القواعد الرائدة عند الشق بنشاطه الإكسونوكليازي 5'→3'، ثم يملأ الفراغ بالقواعد الموسومة. النيوكليوتيدات المعدلة: نظرًا لأن كفاءة دمج النيوكليوتيدات المعدلة أقل عمومًا من نظيراتها الطبيعية، فإن استبدالها بنسبة 100% قد يؤدي إلى توقف البوليميراز. ولتحقيق التوازن بين الإنتاجية وكفاءة الوسم، نوصي عمومًا باختبار نسب مختلفة من النيوكليوتيدات المعدلة إلى النيوكليوتيدات الطبيعية. لا يُنصح باستخدام البوليميرازات التالية في تفاعلات الوسم أو التعبئة الجزئية لصعوبة التحكم في نشاطها الإكسونوكليازي 3'-5': بوليميراز الحمض النووي الأول، الجزء الكبير (كلينو) (M2010)، بوليميراز الحمض النووي T4 (M0203)، بوليميراز الحمض النووي T7 (M0274). س: ما هي الأسباب الرئيسية لفشل تفاعلات التثبيط؟ ج: قد تؤدي الظروف التالية إلى طغيان نشاط الإكسونوكلياز على نشاط البوليميراز، مما ينتج عنه نهايات متراجعة بدلاً من نهايات غير متداخلة: عدم إضافة النيوكليوتيدات، أو انخفاض تركيز النيوكليوتيدات، إضافة كمية كبيرة من الإنزيم، فترة حضانة طويلة جدًا، حضانة في درجات حرارة أعلى من درجة الحرارة الموصى بها، تعطيل الإنزيم بالحرارة بدون EDTA. الأسئلة الشائعة: هل يمكن تعطيل هذا البوليميراز بالحرارة؟ يرجى الاطلاع على بروتوكول إزالة النهايات غير المتداخلة الموصى به لبوليميراز الحمض النووي الأول، الجزء الكبير (كلينو) بالنقر هنا. بوليميراز الحمض النووي T4 بالنقر هنا. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي هذا في محاليل NEBuffers الأخرى لملء أو إزالة النهايات غير المتداخلة؟ ج: لملء النهايات غير المتداخلة 5'، يكون بوليميراز الحمض النووي الأول (الإشريكية القولونية)، وجزء كلينو الكبير، وجزء كلينو (إكسونوكلياز 3'-5')، وبوليميراز الحمض النووي T4 نشطًا في جميع محاليل NEBuffers، ولكن محلول NEBuffer 2/2.1/r2.1 يوفر النشاط الأمثل. يُلاحظ النشاط الأمثل لإنزيم بوليميراز الحمض النووي T7 في محلوله الخاص، بينما ينخفض ​​نشاطه بنسبة 50% في محاليل NEBuffer الأخرى. للمقارنة بين تركيبات محاليل NEBuffer، انقر هنا. للاطلاع على نشاط المزيد من إنزيمات تعديل الحمض النووي في محلول rCutSmart Buffer، انقر هنا. لتقليل تشابك الأطراف، استخدم محاليل NEBuffers، وبوليميراز الحمض النووي الأول (E. coli)، وبوليميراز الحمض النووي الأول، الجزء الكبير (Klenow)، وبوليميراز الحمض النووي T4، وبوليميراز الحمض النووي T7. 1 YNY 50% 1.1 YNY 50% r1.1 YNY 50% 2 مثالي Y 50% 2.1 YYY 50% r2.1 YY مثالي 50% 3 YYN 50% 3.1 YYN 50% r3.1 YYN 50% 4 YYY 50% CutSmart YYY 50% rCutSmart YYY 50% محلول ربط الحمض النووي T4 YY محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي T7 مثالي. يشير الحرف "Y" إلى إمكانية استخدام هذا البوليميراز في المحلول المحدد. يشير الحرف "N" إلى عدم إمكانية استخدام هذا البوليميراز في المحلول المحدد. المحاليل المثلى موضحة. لا يمكن استخدام كلينو (3'-5' exo-) لإزالة الأجزاء البارزة.