نيو إنجلاند بيولابس، M0211S، ميثيل ترانسفيراز EcoRI

الفئات ذات الصلة: ميثيل ترانسفيرازات لعلم التخلق، إنزيمات تعديل القواعد. تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لحماية 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر ضد التحلل بواسطة إنزيم القطع EcoRI. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، مُضاف إليه 80 ميكرومول من S-أدينوسيل ميثيونين (SAM)، يُحضن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مول من أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مول من أسيتات التريس، 10 ملي مول من أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل من الألبومين المؤتلف (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). اختبار الحماية الضابط: يُحضن محلول rCutSmart™ مع 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في 10 ميكرولتر. يُحضّر محلول EcoRI Methyltransferase Buffer بتركيز 1X، مُضافًا إليه 80 ميكرومول من S-أدينوسيل ميثيونين، لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية، تليها 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية. يُحدد مدى الحماية بواسطة EcoRI Methyltransferase بإضافة 40 ميكرولتر من محلول rCutSmart Buffer المُضاف إليه 10 ملي مول من كلوريد المغنيسيوم و5 وحدات من إنزيم EcoRI المقيد. يُحضّن المزيج عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم يُحلل على هلام الأغاروز. محلول التخزين: 100 ملي مولار KPO4، 200 ملي مولار NaCl، 10 ملي مولار β-ME، 0.1 ملي مولار EDTA، 200 ميكروغرام/مل BSA، 50% جلسرين، درجة الحموضة 7.4 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري : 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. الوزن الجزيئي النظري: 37911 دالتون. الأسئلة الشائعة : س: هل يُرفق S-أدينوسيل ميثيونين (SAM) مع إنزيم ميثيل ترانسفيراز؟ ج: نعم، يُرفق محلول مركز بتركيز 32 ملي مولار. يمكن طلبه بشكل منفصل كمنتج رقم NEB# B9003S. يُعد SAM المكون الأكثر حساسية في التفاعل. يجب استبدال المحلول المركز إذا كان عمره أكثر من 9 أشهر. س: ما الذي يجب مراعاته إذا لم يكتمل تفاعل الميثيل؟ ج: يُعد SAM المكون الأكثر حساسية في التفاعل. يجب استبدال المحلول المركز إذا كان عمره أكثر من 6 أشهر. س: هل يمكن تعطيل إنزيم ميثيل ترانسفيراز EcoRI بالحرارة؟ ج: نعم. يُعطَّل عند درجة حرارة 65 مئوية لمدة 20 دقيقة. س: هل يتطلب إنزيم ميثيل ترانسفيراز EcoRI كلوريد المغنيسيوم (MgCl2)؟ ج: لا. س: هل يؤدي مثيلة EcoRI إلى منع إنزيم التقييد ApoI؟ ج: لن يقطع ApoI (RAATTY) مواقع EcoRI إذا كانت مثيلة، ولكنه سيقطع مجموعة المواقع التي ليست مواقع EcoRI. س: هل تعمل أي من إنزيمات ميثيل ترانسفيراز (ميثيلاز) من شركة NEB على الحمض النووي الريبي (RNA)؟ ج: نعم، ينتج إنزيم ميثيل ترانسفيراز EcoGII (NEB #M0603) ما بين 5-10% من بقايا الأدينوزين المثيلة على ركائز الحمض النووي الريبي. مع ذلك، لا تفعل إنزيمات ميثيل ترانسفيراز الأخرى ذلك. يرجى الملاحظة: قامت شركة NEB باختبار ناقلات/ميثيلازات (MT) التالية: ناقل ميثيل dam (NEB #M0222)، ناقل ميثيل AluI (NEB #M0220)، ناقل ميثيل BamHI (NEB #M0223)، ناقل ميثيل M.SssI (NEB #M0226)، ناقل ميثيل EcoRI (NEB #M0211)، ناقل ميثيل M.CviPI (NEB #M0227)، ناقل ميثيل HaeIII (NEB #M0224)، ناقل ميثيل HhaI (NEB #M0217)، ناقل ميثيل HpaII (NEB #M0214)، ناقل ميثيل MspI (NEB #M0215) وناقل ميثيل TaqI (NEB #M0219) باستخدام محاليل التفاعل المرفقة على ركيزتين: 1) تم استخدام 1) mRNA مُستنسخ في المختبر يُشفّر إنزيم لوسيفيراز اليراعة (1 ميكروغرام) و2) RNA الكلي من خلايا هيلا (250 نانوغرام). حُضنت كل ركيزة مع كميتين من الإنزيم (1 و5 ميكرولتر) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية (65 درجة مئوية لإنزيم Taq I MT)، ثم نُقّيت باستخدام عمود طرد مركزي، وهُضمت إلى نيوكليوسيدات منفردة باستخدام مزيج من الإنزيمات، وحُللت بتقنية LC/MS لتحديد البقايا المُعدّلة وغير المُعدّلة. لم يتمكن أي من إنزيمات الميثيلاز التي تم فحصها من نقل مجموعة ميثيل إلى ركائز RNA المدروسة.