نيو إنجلاند بيولابس، M0214S، ميثيل ترانسفيراز HpaII

يتعرف إنزيم ميثيل ترانسفيراز HpaII على نفس التسلسل الذي يتعرف عليه إنزيم ميثيل ترانسفيراز MspI، ولكنه يُعدّل بقايا السيتوزين الداخلية (C). التصنيفات ذات الصلة: ميثيل ترانسفيرازات لعلم التخلق، إنزيمات تعديل القواعد. المواصفات: تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لحماية 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر من الانقسام بواسطة إنزيم القطع HpaII. شروط التفاعل: محلول منظم rCutSmart™ بتركيز 1X، مُضاف إليه 80 ميكرومول من S-أدينوسيل ميثيونين (SAM)، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول منظم rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مول من أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مول من أسيتات التريس، 10 ملي مول من أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل من الألبومين المُعاد تركيبه (الأس الهيدروجيني 7.9). اختبار الحماية الضابطة (25 درجة مئوية): يُحضن إنزيم ميثيل ترانسفيراز HpaII مع 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في 10 ميكرولتر من محلول rCutSmart Buffer بتركيز 1X، مُضافًا إليه 80 ميكرومول من S-أدينوسيل ميثيونين، لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية، تليها 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية. يُحدد مدى الحماية بواسطة إنزيم ميثيل ترانسفيراز HpaII بإضافة 40 ميكرولتر من محلول NEBuffer 1 مُضافًا إليه 10 ملي مول من كلوريد المغنيسيوم و10 وحدات من إنزيم القطع HpaII. يُحضن المزيج عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم يُحلل على هلام الأغاروز. محلول التخزين: 50 ملي مول من Tris-HCl، 150 ملي مول من كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي مول من EDTA، 5 ملي مول من TCEP، 200 ميكروغرام/مل من ألبومين المصل البقري، 50% جلسرين، درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية، تعطيل حراري عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، الوزن الجزيئي النظري: 40397 دالتون. الأسئلة الشائعة : س: هل يُزوَّد إنزيم ميثيل ترانسفيراز بمادة S-أدينوسيل ميثيونين (SAM)؟ ج: نعم، يُزوَّد بمحلول مركز بتركيز 32 ملي مولار. ويمكن طلبه بشكل منفصل كمنتج رقم NEB# B9003S. يُعدّ SAM المكون الأكثر حساسية في التفاعل. يجب استبدال المحلول المركز إذا كان عمره أكثر من 9 أشهر. س: ما الذي يجب مراعاته إذا لم تكتمل عملية المَثْيَلَة؟ ج: يُعدّ SAM المكون الأكثر حساسية في التفاعل. يجب استبدال المحلول المركز إذا كان عمره أكثر من 6 أشهر. س: هل يمكن تعطيل إنزيم ميثيل ترانسفيراز HpaII بالحرارة؟ ج: نعم. يُعطَّل عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. س: هل يتطلب إنزيم ميثيل ترانسفيراز HpaII كلوريد المغنيسيوم (MgCl2)؟ ج: لا. س: ما هو الوزن الجزيئي لـ هل يمكن استخدام إنزيم ميثيل ترانسفيراز HpaII؟ ج: الوزن الجزيئي 40397 دالتون. س: هل يمكن استخدام الحمض النووي الميثيلي HpaII لتحويل بكتيريا الإشريكية القولونية؟ ج: الحمض النووي الميثيلي HpaII حساس لجين mcrA. يجب استخدام سلالة من الإشريكية القولونية تفتقر إلى جين mcrA وإلا سيتحلل الحمض النووي. س: هل تعمل أي من إنزيمات ميثيل ترانسفيراز (ميثيلاز) من شركة NEB على الحمض النووي الريبي (RNA)؟ ج: نعم، ينتج إنزيم ميثيل ترانسفيراز EcoGII (NEB #M0603) من 5 إلى 10% من بقايا الأدينوزين الميثيلية على ركائز الحمض النووي الريبي. مع ذلك، لا تنتج إنزيمات ميثيل ترانسفيراز الأخرى هذه النسبة. ملاحظة: اختبرت شركة NEB إنزيمات النقل/الميثيلاز التالية: ميثيل ترانسفيراز dam (NEB #M0222)، ميثيل ترانسفيراز AluI (NEB #M0220)، ميثيل ترانسفيراز BamHI (NEB #M0223). M.SssI ميثيل ترانسفيراز (NEB #M0226)، EcoRI ميثيل ترانسفيراز (NEB #M0211)، M.CviPI ميثيل ترانسفيراز (NEB #M0227)، HaeIII ميثيل ترانسفيراز (NEB #M0224)، HhaI ميثيل ترانسفيراز (NEB #M0217)، HpaII ميثيل ترانسفيراز (NEB #M0214)، MspI ميثيل ترانسفيراز (NEB #M0215) و TaqI ميثيل ترانسفيراز (NEB #M0219) باستخدام محاليل التفاعل المرفقة بها على ركيزتين: 1) mRNA مستنسخ في المختبر يشفر لوسيفيراز اليراعة (1 ميكروغرام) و 2) إجمالي RNA HeLa (250 نانوغرام). تم تحضين كل ركيزة مع كميتين من الإنزيم (1 و5 ميكرولتر) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية (65 درجة مئوية لإنزيم Taq I MT)، ثم تم تنقيتها باستخدام عمود طرد مركزي، وهضمها إلى نيوكليوسيدات منفردة باستخدام مزيج من الإنزيمات، وتحليلها بواسطة تقنية LC/MS لتحديد البقايا المعدلة وغير المعدلة. لم يتمكن أي من إنزيمات الميثيلاز التي تم فحصها من نقل مجموعة ميثيل إلى ركائز الحمض النووي الريبي (RNA) التي تم فحصها. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من الألبومين البقري المصل (BSA) إلى الألبومين المؤتلف (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسر شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري المصل (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المؤتلف (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). نعمل حاليًا على تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونعتقد أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونستطيع تقديم هذا التحسين بنفس السعر.