نيو إنجلاند بيولابس، M0215S، ميثيل ترانسفيراز MspI

الفئات ذات الصلة: ميثيل ترانسفيراز لعلم التخلق، إنزيمات تعديل القواعد. تعريف الوحدة: تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لحماية 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر ضد الانقسام بواسطة إنزيم التقييد MspI. شروط التفاعل: محلول تفاعل ميثيلاز MspI بتركيز 1X، مضاف إليه 80 ميكرومول من S-أدينوسيل ميثيونين (SAM)، حضن عند 37 درجة مئوية. محلول تفاعل ميثيلاز MspI بتركيز 1X، 50 ملي مول من Tris-HCl، 100 ملي مول من NaCl، 5 ملي مول من β-ME، 10 ملي مول من EDTA (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). اختبار الحماية للتحكم: يتم تحضين ميثيل ترانسفيراز MspI مع 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في 10 ميكرولتر من محلول تفاعل ميثيل ترانسفيراز MspI بتركيز 1X، مضاف إليه 80 ميكرومول من S-أدينوسيل ميثيونين، لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية، تليها 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية. يُحدد مدى الحماية التي يوفرها إنزيم ميثيل ترانسفيراز MspI بإضافة 40 ميكرولتر من محلول NEBuffer 2 المُدعّم بـ 10 ملي مولار من كلوريد المغنيسيوم و5 وحدات من إنزيم القطع MspI. يُحضن إنزيم MspI عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، ثم يُحلل على هلام الأغاروز. محلول التخزين : 50 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار NaCl، 5 ملي مولار β-ME، 10 ملي مولار EDTA، 200 ميكروغرام/مل BSA، 50% جلسرين، درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : لا. الوزن الجزيئي النظري: 40397 دالتون. الأسئلة الشائعة : س: هل يُرفق S-أدينوسيل ميثيونين (SAM) مع إنزيم ميثيل ترانسفيراز؟ ج: نعم، يُرفق محلول أساسي بتركيز 32 ملي مولار. ويمكن طلبه بشكل منفصل كمنتج رقم NEB# B9003S. يُعدّ SAM المكون الأكثر حساسية في التفاعل. يجب استبدال المحلول الأصلي إذا كان عمره أكثر من 9 أشهر. س: ما الذي يجب مراعاته إذا لم تكتمل عملية المثيلة؟ ج: يُعدّ SAM المكون الأكثر حساسية في التفاعل. يجب استبدال المحلول الأصلي إذا كان عمره أكثر من 6 أشهر. س: ما هو الوزن الجزيئي لإنزيم ميثيل ترانسفيراز MspI؟ ج: الوزن الجزيئي 47,654 دالتون. س: هل تعمل أي من إنزيمات ميثيل ترانسفيراز (ميثيلاز) من شركة NEB على الحمض النووي الريبي (RNA)؟ ج: نعم، يُنتج إنزيم ميثيل ترانسفيراز EcoGII (NEB #M0603) ما بين 5-10% من بقايا الأدينوزين المثيلة على ركائز الحمض النووي الريبي. مع ذلك، لا تُنتج إنزيمات ميثيل ترانسفيراز الأخرى هذه البقايا. يرجى الملاحظة: قامت شركة NEB باختبار ناقلات/ميثيلازات (MT) التالية: ناقل ميثيل dam (NEB #M0222)، ناقل ميثيل AluI (NEB #M0220)، ناقل ميثيل BamHI (NEB #M0223)، ناقل ميثيل M.SssI (NEB #M0226)، ناقل ميثيل EcoRI (NEB #M0211)، ناقل ميثيل M.CviPI (NEB #M0227)، ناقل ميثيل HaeIII (NEB #M0224)، ناقل ميثيل HhaI (NEB #M0217)، ناقل ميثيل HpaII (NEB #M0214)، ناقل ميثيل MspI (NEB #M0215) وناقل ميثيل TaqI (NEB #M0219) باستخدام محاليل التفاعل المرفقة على ركيزتين: 1) تم استخدام 1) mRNA مُستنسخ في المختبر يُشفّر إنزيم لوسيفيراز اليراعة (1 ميكروغرام) و2) RNA الكلي من خلايا هيلا (250 نانوغرام). حُضنت كل ركيزة مع كميتين من الإنزيم (1 و5 ميكرولتر) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية (65 درجة مئوية لإنزيم Taq I MT)، ثم نُقّيت باستخدام عمود طرد مركزي، وهُضمت إلى نيوكليوسيدات منفردة باستخدام مزيج من الإنزيمات، وحُللت بتقنية LC/MS لتحديد البقايا المُعدّلة وغير المُعدّلة. لم يتمكن أي من إنزيمات الميثيلاز التي تم فحصها من نقل مجموعة ميثيل إلى ركائز RNA المدروسة.