نيو إنجلاند بيولابس، M0217S، ميثيل ترانسفيراز Hhal

يقوم إنزيم ميثيل ترانسفيراز HhaI بتعديل بقايا السيتوزين الداخلية (C). الفئات ذات الصلة : ميثيل ترانسفيراز لعلم التخلق، إنزيمات تعديل القواعد. المواصفات: تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لحماية 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر ضد الانقسام بواسطة إنزيم القطع HhaI. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، مضاف إليه 80 ميكرومول من S-أدينوسيل ميثيونين (SAM)، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مول من أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مول من أسيتات التريس، 10 ملي مول من أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل من الألبومين المؤتلف (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). اختبار الحماية للتحكم: إنزيم ميثيل ترانسفيراز HhaI هو يُحضن مع 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في 10 ميكرولتر من محلول rCutSmart Buffer بتركيز 1X، مُضافًا إليه 80 ميكرومول من S-أدينوسيل ميثيونين، لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية، تليها 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية. يُحدد مدى الحماية بواسطة إنزيم ميثيل ترانسفيراز HhaI بإضافة 40 ميكرولتر من محلول rCutSmart Buffer مُضافًا إليه 100 ميكروغرام/مل من ألبومين المصل البقري (BSA)، و10 ملي مول من كلوريد المغنيسيوم (MgCl₂)، و10 وحدات من إنزيم القطع HhaI. يُحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم يُحلل على هلام الأغاروز. محلول التخزين : 50 ملي مول من Tris-HCl، 150 ملي مول من كلوريد الصوديوم (NaCl)، 5 ملي مول من TCEP، 0.1 ملي مول من EDTA، 200 ميكروغرام/مل من ألبومين المصل البقري (BSA)، درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: لا. الوزن الجزيئي النظري: 36994 دالتون. الأسئلة الشائعة : س: هل يُرفق S-أدينوسيل ميثيونين (SAM) مع إنزيم ميثيل ترانسفيراز؟ ج: نعم، يُرفق محلول مركز بتركيز 32 ملي مولار. ويمكن طلبه بشكل منفصل كمنتج NEB# B9003S. يُعد SAM المكون الأكثر حساسية في التفاعل. يجب استبدال المحلول المركز إذا تجاوز عمره 9 أشهر. س: ما الذي يجب مراعاته إذا لم تكتمل عملية المَثْيَلَة؟ ج: يُعد SAM المكون الأكثر حساسية في التفاعل. يجب استبدال المحلول المركز إذا تجاوز عمره 6 أشهر. س: ما هو الوزن الجزيئي لإنزيم ميثيل ترانسفيراز HhaI؟ ج: الوزن الجزيئي 36994 دالتون. س: هل تعمل أي من إنزيمات ميثيل ترانسفيراز (ميثيلاز) من NEB على الحمض النووي الريبي (RNA)؟ ج: نعم، ينتج إنزيم ميثيل ترانسفيراز EcoGII (NEB #M0603) 5-10% من الحمض النووي الريبي الميثيلي. بقايا الأدينوزين على ركائز الحمض النووي الريبي. مع ذلك، لا تقوم ناقلات الميثيل الأخرى بذلك. يرجى ملاحظة ما يلي: اختبرت شركة NEB ناقلات/ميثيلازات (MT) التالية: ناقل ميثيل dam (NEB #M0222)، ناقل ميثيل AluI (NEB #M0220)، ناقل ميثيل BamHI (NEB #M0223)، ناقل ميثيل M.SssI (NEB #M0226)، ناقل ميثيل EcoRI (NEB #M0211)، ناقل ميثيل M.CviPI (NEB #M0227)، ناقل ميثيل HaeIII (NEB #M0224)، ناقل ميثيل HhaI (NEB #M0217)، ناقل ميثيل HpaII (NEB #M0214)، ناقل ميثيل MspI (NEB #M0215) و TaqI تم استخدام إنزيم ميثيل ترانسفيراز (NEB #M0219) مع محاليل التفاعل المرفقة على ركيزتين: 1) mRNA مُستنسخ في المختبر يُشفّر إنزيم لوسيفيراز اليراعة (1 ميكروغرام)، و2) RNA الكلي من خلايا هيلا (250 نانوغرام). حُضنت كل ركيزة مع كميتين من الإنزيم (1 و5 ميكرولتر) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية (65 درجة مئوية لإنزيم Taq I MT)، ثم نُقّيت باستخدام عمود طرد مركزي، وهُضمت إلى نيوكليوسيدات منفردة باستخدام مزيج من الإنزيمات، وحُللت بتقنية LC/MS لتحديد البقايا المُعدّلة وغير المُعدّلة. لم يتمكن أي من إنزيمات الميثيل ترانسفيراز التي تم فحصها من نقل مجموعة ميثيل إلى ركائز RNA المدروسة. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من BSA إلى الألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونرى أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر.