نيو إنجلاند بيولابس، M0219S، ناقل ميثيل TaqI

الفئات ذات الصلة: ميثيل ترانسفيراز لعلم التخلق، إنزيمات تعديل القواعد. تعريف الوحدة: تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لحماية 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند 65 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر ضد الانقسام بواسطة إنزيم القطع Taq I. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، مضاف إليه 80 ميكرومول من S-أدينوسيل ميثيونين (SAM)، يُحضن عند 65 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مول من أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مول من أسيتات التريس، 10 ملي مول من أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل من الألبومين المؤتلف (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). اختبار الحماية للتحكم : شروط اختبار الحماية: يُحضن إنزيم Taq I ميثيل ترانسفيراز مع 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في 20 ميكرولتر من محلول rCutSmart™ بتركيز 1X و80 ميكرومول من S-أدينوسيل ميثيونين، لمدة ساعة واحدة عند 65 درجة مئوية. يُحدد مدى الحماية بواسطة إنزيم ميثيل ترانسفيراز Taq I بإضافة 30 ميكرولتر من محلول rCutSmart Buffer بتركيز 1X و10 وحدات من إنزيم القطع Taq I. يُحضن المزيج لمدة 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية، ثم يُحلل على هلام الأغاروز. محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار NaCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 200 ميكروغرام/مل BSA، 50% جلسرين، درجة الحموضة 7.4 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : لا. الوزن الجزيئي النظري: 47845 دالتون. الأسئلة الشائعة : س: هل يُرفق S-أدينوسيل ميثيونين (SAM) مع إنزيم ميثيل ترانسفيراز؟ ج: نعم، يُرفق محلول مركز بتركيز 32 ملي مولار. يمكن طلبه بشكل منفصل كمنتج رقم NEB# B9003S. يُعد SAM المكون الأكثر حساسية في التفاعل. إذا كان المحلول الأصلي أقدم من 9 أشهر، فيجب استبداله. س: ما الذي يجب مراعاته إذا لم تكتمل عملية المثيلة؟ ج: يُعدّ SAM المكون الأكثر حساسية في التفاعل. إذا كان المحلول الأصلي أقدم من 6 أشهر، فيجب استبداله. س: ما هو نشاط إنزيم TaqI ميثيل ترانسفيراز عند 37 درجة مئوية؟ ج: يُعطي إنزيم TaqI ميثيل ترانسفيراز نشاطًا بنسبة 25% عند 37 درجة مئوية. س: ما هو نشاط إنزيم TaqI ميثيل ترانسفيراز عند 50 درجة مئوية؟ ج: النشاط يقارب 100%. يمكن استخدام الإنزيم على الحمض النووي المدمج في الأغاروز منخفض الانصهار عند هذه الدرجة. لن يذوب السدادة. س: هل يتطلب إنزيم TaqI ميثيل ترانسفيراز كلوريد المغنيسيوم؟ ج: لا. س: هل يتطلب إنزيم TaqI ميثيل ترانسفيراز ألبومين المصل البقري؟ ج: نعم، يزيد كل من الألبومين البقري المصل (BSA) والألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) من نشاط إنزيم ميثيل ترانسفيراز TaqI بمقدار أربعة أضعاف. س: ما هو نشاط إنزيم ميثيل ترانسفيراز TaqI في محاليل منظمة أخرى؟ ج: يبلغ نشاط إنزيم ميثيل ترانسفيراز TaqI حوالي 50% في محلول NEBuffer 3. س: ما هو الوزن الجزيئي لإنزيم ميثيل ترانسفيراز TaqI؟ ج: يبلغ الوزن الجزيئي 47845 دالتون. س: هل يُستخدم إنزيم ميثيل ترانسفيراز TaqI في أي تقنيات خاصة؟ ج: نعم. يُمكن استخدام إنزيم ميثيل ترانسفيراز TaqI (TCGA*) لإنشاء موقع التعرف المكون من 8 قواعد TCGA*TCGA، والذي يُمكن قطعه بواسطة إنزيم DpnI. يتعرف إنزيم DpnI على تسلسل GATC ويقطعه عندما يكون الحمض النووي مثيلًا. تجنب الإفراط في هضم الحمض النووي لأن إنزيم DpnI سيقطع الحمض النووي نصف المثيل ببطء (TCGATC). س: هل تعمل أي من إنزيمات ميثيل ترانسفيراز (ميثيلاز) من شركة NEB على الحمض النووي الريبي (RNA)؟ ج: نعم، ينتج إنزيم ميثيل ترانسفيراز EcoGII (NEB #M0603) ما بين 5 و10% من بقايا الأدينوزين الميثيلية على ركائز الحمض النووي الريبي. مع ذلك، لا تفعل ذلك إنزيمات ميثيل ترانسفيراز الأخرى. يرجى الملاحظة: قامت شركة NEB باختبار ناقلات/ميثيلازات (MT) التالية: ناقل ميثيل dam (NEB #M0222)، ناقل ميثيل AluI (NEB #M0220)، ناقل ميثيل BamHI (NEB #M0223)، ناقل ميثيل M.SssI (NEB #M0226)، ناقل ميثيل EcoRI (NEB #M0211)، ناقل ميثيل M.CviPI (NEB #M0227)، ناقل ميثيل HaeIII (NEB #M0224)، ناقل ميثيل HhaI (NEB #M0217)، ناقل ميثيل HpaII (NEB #M0214)، ناقل ميثيل MspI (NEB #M0215) وناقل ميثيل TaqI (NEB #M0219) باستخدام محاليل التفاعل المرفقة على ركيزتين: 1) تم استخدام 1) mRNA مُستنسخ في المختبر يُشفّر إنزيم لوسيفيراز اليراعة (1 ميكروغرام) و2) RNA الكلي من خلايا هيلا (250 نانوغرام). حُضنت كل ركيزة مع كميتين من الإنزيم (1 و5 ميكرولتر) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية (65 درجة مئوية لإنزيم Taq I MT)، ثم نُقيت باستخدام عمود طرد مركزي، وهُضمت إلى نيوكليوسيدات منفردة باستخدام مزيج من الإنزيمات، وحُللت بتقنية LC/MS لتحديد البقايا المُعدلة وغير المُعدلة. لم يتمكن أي من إنزيمات الميثيلاز التي تم فحصها من نقل مجموعة ميثيل إلى ركائز RNA التي تم فحصها. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من BSA إلى الألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في NEBuffers؟ يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونرى أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر.