نيو إنجلاند بيولابس، M0220S، ناقل ميثيل AluI

الفئات ذات الصلة: ميثيل ترانسفيرازات لعلم التخلق، إنزيمات تعديل القواعد. تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لحماية 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ خلال ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر من القطع بواسطة إنزيم القطع الداخلي AluI. شروط التفاعل: محلول تفاعل ميثيل ترانسفيراز AluI بتركيز 1X، مُضاف إليه 80 ميكرومول من S-أدينوسيل ميثيونين (SAM)، يُحضن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. اختبار الحماية الضابط: يُحضن إنزيم ميثيل ترانسفيراز AluI مع 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في 10 ميكرولتر من محلول تفاعل ميثيل ترانسفيراز AluI بتركيز 1X، مُضاف إليه 80 ميكرومول من S-أدينوسيل ميثيونين، لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، تليها 15 دقيقة عند درجة حرارة 65 درجة مئوية. يُحدد مدى الحماية بواسطة إنزيم ميثيل ترانسفيراز AluI بإضافة 40 ميكرولتر من محلول NEBuffer 1 المُدعّم بـ 10 ملي مولار من كلوريد المغنيسيوم و10 وحدات من إنزيم القطع الداخلي AluI. يُحضن المزيج عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم يُحلل على هلام الأغاروز. محلول التخزين : 10 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 200 ميكروغرام/مل BSA، 50% جلسرين، درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. الأسئلة الشائعة : س: هل يُرفق S-أدينوسيل ميثيونين (SAM) مع إنزيم ميثيل ترانسفيراز؟ ج: نعم، يُرفق محلول أساسي بتركيز 32 ملي مولار. يمكن طلبه بشكل منفصل كمنتج رقم NEB# B9003S. يُعد SAM المكون الأكثر حساسية في التفاعل. إذا كان المحلول الأصلي أقدم من 9 أشهر، فيجب استبداله. س: ما الذي يجب مراعاته إذا لم تكتمل عملية المثيلة؟ ج: يُعدّ SAM المكون الأكثر حساسية في التفاعل. إذا كان المحلول الأصلي أقدم من 6 أشهر، فيجب استبداله. س: هل يمكن تعطيل إنزيم AluI Methyltransferase بالحرارة؟ ج: نعم. يُعطّل عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. س: هل يتطلب إنزيم AluI Methyltransferase كلوريد المغنيسيوم (MgCl2)؟ ج: لا. س: ما هو الوزن الجزيئي لإنزيم AluI Methyltransferase؟ ج: الوزن الجزيئي 61493 دالتون. س: هل يمكن استخدام الحمض النووي المُمَثْيَل بواسطة AluI لتحويل بكتيريا الإشريكية القولونية؟ ج: الحمض النووي المُمَثْيَل بواسطة AluI حساس لجين mcrB. يجب استخدام سلالة من الإشريكية القولونية تفتقر إلى جين mcrB وإلا سيتحلل الحمض النووي. س: هل تمنع المثيلة بواسطة إنزيم AluI Methyltransferase إنزيم SacI المقيد؟ ج: نعم. س: هل تعمل أي من إنزيمات ميثيل ترانسفيراز (ميثيلاز) من شركة NEB على الحمض النووي الريبي (RNA)؟ ج: نعم، ينتج إنزيم ميثيل ترانسفيراز EcoGII (NEB #M0603) ما بين 5-10% من بقايا الأدينوزين الميثيلية على ركائز الحمض النووي الريبي. مع ذلك، لا تفعل ذلك إنزيمات ميثيل ترانسفيراز الأخرى. يرجى الملاحظة: قامت شركة NEB باختبار ناقلات/ميثيلازات (MT) التالية: ناقل ميثيل dam (NEB #M0222)، ناقل ميثيل AluI (NEB #M0220)، ناقل ميثيل BamHI (NEB #M0223)، ناقل ميثيل M.SssI (NEB #M0226)، ناقل ميثيل EcoRI (NEB #M0211)، ناقل ميثيل M.CviPI (NEB #M0227)، ناقل ميثيل HaeIII (NEB #M0224)، ناقل ميثيل HhaI (NEB #M0217)، ناقل ميثيل HpaII (NEB #M0214)، ناقل ميثيل MspI (NEB #M0215) وناقل ميثيل TaqI (NEB #M0219) باستخدام محاليل التفاعل المرفقة على ركيزتين: 1) تم استخدام 1) mRNA مُستنسخ في المختبر يُشفّر إنزيم لوسيفيراز اليراعة (1 ميكروغرام) و2) RNA الكلي من خلايا هيلا (250 نانوغرام). حُضنت كل ركيزة مع كميتين من الإنزيم (1 و5 ميكرولتر) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية (65 درجة مئوية لإنزيم Taq I MT)، ثم نُقّيت باستخدام عمود طرد مركزي، وهُضمت إلى نيوكليوسيدات منفردة باستخدام مزيج من الإنزيمات، وحُللت بتقنية LC/MS لتحديد البقايا المُعدّلة وغير المُعدّلة. لم يتمكن أي من إنزيمات الميثيلاز التي تم فحصها من نقل مجموعة ميثيل إلى ركائز RNA المدروسة.