مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، M0222S، ناقل ميثيل دام

الفئات ذات الصلة: ميثيل ترانسفيرازات لعلم التخلق الوراثي. تعريف الوحدة: تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لحماية 1 ميكروغرام (dam-) من الحمض النووي لامدا في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر ضد الانقسام بواسطة إنزيم التقييد MboI. شروط التفاعل: محلول تفاعل ميثيل ترانسفيراز dam بتركيز 1X، مضاف إليه 80 ميكرومول من S-أدينوسيل ميثيونين (SAM)، حضن عند 37 درجة مئوية. محلول تفاعل ميثيل ترانسفيراز dam بتركيز 1X، 50 ملي مول من Tris-HCl، 5 ملي مول من β-ME، 10 ملي مول من EDTA (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). اختبار الحماية للتحكم: يتم تحضين ميثيل ترانسفيراز dam مع 1 ميكروغرام من (dam-) Lambda DNA في 10 ميكرولتر من محلول ميثيل ترانسفيراز dam بتركيز 1X، مضاف إليه 80 ميكرومول من S-أدينوسيل ميثيونين، لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية، تليها 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية. يُحدد مدى الحماية بإضافة 40 ميكرولتر من محلول NEBuffer 3 بتركيز 1X مُدعّم بـ 10 ملي مولار من كلوريد المغنيسيوم و10 وحدات من إنزيم القطع MboI. يُحضن المزيج عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، ثم يُحلل على هلام الأغاروز. محلول التخزين: 50 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 10 ملي مولار EDTA، 200 ميكروغرام/مل BSA، 50% جلسرين، درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. الأسئلة الشائعة : س: هل يُرفق S-أدينوسيل ميثيونين (SAM) مع إنزيم ميثيل ترانسفيراز؟ ج: نعم، يُرفق محلول أساسي بتركيز 32 ملي مولار. يمكن طلبه بشكل منفصل كمنتج رقم NEB# B9003S. يُعد SAM المكون الأكثر حساسية في التفاعل. إذا كان المحلول الأصلي أقدم من 9 أشهر، فيجب استبداله. س: ما الذي يجب مراعاته إذا لم تكتمل عملية المثيلة؟ ج: يُعد SAM المكون الأكثر حساسية في التفاعل. إذا كان المحلول الأصلي أقدم من 6 أشهر، فيجب استبداله. س: هل يمكن تعطيل إنزيم ميثيل ترانسفيراز dam بالحرارة؟ ج: نعم. يُعطل عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. س: هل يتطلب إنزيم ميثيل ترانسفيراز dam كلوريد المغنيسيوم؟ ج: لا. س: هل إنزيم ميثيل ترانسفيراز dam حساس للملح؟ ج: نعم. تأكد من أن محلول الحمض النووي منخفض التركيز الملحي أو أنه يشكل نسبة صغيرة فقط من حجم التفاعل النهائي. إذا كان الملح يمثل مشكلة، قلل تركيز الملح عن طريق التقطير. س: هل يقوم إنزيم DpnI بقطع الحمض النووي dam المُمَثْيَل؟ ج: نعم. س: هل تعمل أي من إنزيمات ميثيل ترانسفيراز (ميثيلاز) NEB على الحمض النووي الريبي (RNA)؟ ج: نعم، ينتج إنزيم ميثيل ترانسفيراز EcoGII (NEB #M0603) ما بين 5-10% من بقايا الأدينوزين الميثيلية على ركائز الحمض النووي الريبي. مع ذلك، لا تنتج إنزيمات ميثيل ترانسفيراز الأخرى هذه البقايا. يرجى الملاحظة: قامت شركة NEB باختبار ناقلات/ميثيلازات (MT) التالية: ناقل ميثيل dam (NEB #M0222)، ناقل ميثيل AluI (NEB #M0220)، ناقل ميثيل BamHI (NEB #M0223)، ناقل ميثيل M.SssI (NEB #M0226)، ناقل ميثيل EcoRI (NEB #M0211)، ناقل ميثيل M.CviPI (NEB #M0227)، ناقل ميثيل HaeIII (NEB #M0224)، ناقل ميثيل HhaI (NEB #M0217)، ناقل ميثيل HpaII (NEB #M0214)، ناقل ميثيل MspI (NEB #M0215) وناقل ميثيل TaqI (NEB #M0219) باستخدام محاليل التفاعل المرفقة على ركيزتين: 1) تم استخدام 1) mRNA مُستنسخ في المختبر يُشفّر إنزيم لوسيفيراز اليراعة (1 ميكروغرام) و2) RNA الكلي من خلايا هيلا (250 نانوغرام). حُضنت كل ركيزة مع كميتين من الإنزيم (1 و5 ميكرولتر) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية (65 درجة مئوية لإنزيم Taq I MT)، ثم نُقّيت باستخدام عمود طرد مركزي، وهُضمت إلى نيوكليوسيدات منفردة باستخدام مزيج من الإنزيمات، وحُللت بتقنية LC/MS لتحديد البقايا المُعدّلة وغير المُعدّلة. لم يتمكن أي من إنزيمات الميثيلاز التي تم فحصها من نقل مجموعة ميثيل إلى ركائز RNA المدروسة.