نيو إنجلاند بيولابس، M0223S، ميثيل ترانسفيراز BamHI

تم إيقاف إنتاج الحجم الكبير من هذا المنتج بتاريخ 31/12/2020. وسيظل الحجم الصغير متوفرًا. الفئات ذات الصلة: ميثيل ترانسفيرازات لعلم التخلق، إنزيمات تعديل القواعد. تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لحماية 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر من التحلل بواسطة إنزيم القطع BamHI. شروط التفاعل: محلول تفاعل ميثيل ترانسفيراز BamHI بتركيز 1X، مُضاف إليه 80 ميكرومول من S-أدينوسيل ميثيونين (SAM). يُحضن المزيج عند 37 درجة مئوية. اختبار الحماية: يُحضن إنزيم ميثيل ترانسفيراز BamHI مع 1 ميكروغرام من DNA λ في 10 ميكرولتر من محلول تفاعل ميثيل ترانسفيراز BamHI بتركيز 1X، مُضافًا إليه 80 ميكرومول من S-أدينوسيل ميثيونين، لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية، تليها 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية. يُحدد مدى الحماية بواسطة إنزيم ميثيل ترانسفيراز BamHI بإضافة 40 ميكرولتر من محلول NEBuffer 1 مُضافًا إليه 10 ملي مول من MgCl₂ و10 وحدات من إنزيم BamHI المُقيد. يُحضن المزيج عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم يُحلل على هلام الأغاروز. محلول التخزين: 50 ملي مولار Tris-HCl، 1 ملي مولار DTT، 10 ملي مولار EDTA، 200 ميكروغرام/مل BSA، 50% جلسرين، درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري : لا. الأسئلة الشائعة : س: هل يُرفق S-أدينوسيل ميثيونين (SAM) مع إنزيم ميثيل ترانسفيراز؟ ج: نعم، يُرفق محلول مركز بتركيز 32 ملي مولار. ويمكن طلبه بشكل منفصل كمنتج رقم NEB# B9003S. يُعد SAM المكون الأكثر حساسية في التفاعل. يجب استبدال المحلول المركز إذا تجاوز عمره 9 أشهر. س: ما الذي يجب مراعاته إذا لم يكتمل تفاعل الميثيل؟ ج: يُعد SAM المكون الأكثر حساسية في التفاعل. يجب استبدال المحلول المركز إذا تجاوز عمره 6 أشهر. س: ما الوزن الجزيئي لإنزيم BamHI ميثيل ترانسفيراز؟ ج: الوزن الجزيئي 49223 دالتون. س: هل تعمل أي من إنزيمات ميثيل ترانسفيراز (ميثيلاز) من شركة NEB على الحمض النووي الريبي (RNA)؟ ج: نعم، ينتج إنزيم ميثيل ترانسفيراز EcoGII (NEB #M0603) ما بين 5 و10% من بقايا الأدينوزين الميثيلية على ركائز الحمض النووي الريبي. مع ذلك، لا تفعل ذلك إنزيمات ميثيل ترانسفيراز الأخرى. يرجى الملاحظة: قامت شركة NEB باختبار ناقلات/ميثيلازات (MT) التالية: ناقل ميثيل dam (NEB #M0222)، ناقل ميثيل AluI (NEB #M0220)، ناقل ميثيل BamHI (NEB #M0223)، ناقل ميثيل M.SssI (NEB #M0226)، ناقل ميثيل EcoRI (NEB #M0211)، ناقل ميثيل M.CviPI (NEB #M0227)، ناقل ميثيل HaeIII (NEB #M0224)، ناقل ميثيل HhaI (NEB #M0217)، ناقل ميثيل HpaII (NEB #M0214)، ناقل ميثيل MspI (NEB #M0215) وناقل ميثيل TaqI (NEB #M0219) باستخدام محاليل التفاعل المرفقة على ركيزتين: 1) تم استخدام 1) mRNA مُستنسخ في المختبر يُشفّر إنزيم لوسيفيراز اليراعة (1 ميكروغرام) و2) RNA الكلي من خلايا هيلا (250 نانوغرام). حُضنت كل ركيزة مع كميتين من الإنزيم (1 و5 ميكرولتر) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية (65 درجة مئوية لإنزيم Taq I MT)، ثم نُقّيت باستخدام عمود طرد مركزي، وهُضمت إلى نيوكليوسيدات منفردة باستخدام مزيج من الإنزيمات، وحُللت بتقنية LC/MS لتحديد البقايا المُعدّلة وغير المُعدّلة. لم يتمكن أي من إنزيمات الميثيلاز التي تم فحصها من نقل مجموعة ميثيل إلى ركائز RNA المدروسة.