نيو إنجلاند بيولابس، M0224S، ميثيل ترانسفيراز HaeIII

يقوم إنزيم ميثيل ترانسفيراز HaeIII بتعديل بقايا السيتوزين الداخلية (C5) في التسلسل GGCC. التصنيفات ذات الصلة : ميثيل ترانسفيرازات لعلم التخلق، إنزيمات تعديل القواعد. تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لحماية 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر من التحلل بواسطة إنزيم القطع الداخلي HaeIII. شروط التفاعل: محلول تفاعل ميثيل ترانسفيراز HaeIII بتركيز 1X، مُضاف إليه 80 ميكرومول من S-أدينوسيل ميثيونين (SAM). يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول تفاعل ميثيل ترانسفيراز HaeIII بتركيز 1X، 50 ملي مول من Tris-HCl، 50 ملي مول من NaCl، 10 ملي مول من DTT (الأس الهيدروجيني 8.5 عند 25 درجة مئوية). اختبار الحماية الضابط: يُحضن إنزيم ميثيل ترانسفيراز HaeIII مع 1 ميكروغرام من DNA λ في 10 ميكرولتر من محلول تفاعل ميثيل ترانسفيراز HaeIII بتركيز 1X، مُضاف إليه 80 ميكرومول من S-أدينوسيل ميثيونين، لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية، تليها 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية. يُحدد مدى الحماية بإضافة 40 ميكرولتر من محلول NEBuffer 2.1 و10 وحدات من إنزيم القطع الداخلي HaeIII. بعد الحضانة لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، يتم التحليل باستخدام هلام الأغاروز. محلول التخزين: 50 ملي مولار Tris-HCl، 1 ملي مولار DTT، 10 ملي مولار EDTA، 200 ميكروغرام/مل BSA، 50% جلسرين، 50 ملي مولار KCl، درجة الحموضة 7.4 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. الأسئلة الشائعة : س: هل يُرفق S-أدينوسيل ميثيونين (SAM) مع إنزيم ميثيل ترانسفيراز؟ ج: نعم، يُرفق محلول مركز بتركيز 32 ملي مولار. يمكن طلبه بشكل منفصل كمنتج رقم NEB# B9003S. يُعد SAM المكون الأكثر حساسية في التفاعل. يجب استبدال المحلول المركز إذا كان عمره أكثر من 9 أشهر. س: ما الذي يجب مراعاته إذا لم يكتمل تفاعل الميثيل؟ ج: يُعد SAM المكون الأكثر حساسية في التفاعل. يجب استبدال المحلول المركز إذا كان عمره أكثر من 6 أشهر. س: هل يتطلب إنزيم ميثيل ترانسفيراز HaeIII وجود DTT؟ ج: نعم. جرب استخدام محلول منظم جديد إذا بدا النشاط منخفضًا. س: هل يمكن تعطيل إنزيم ميثيل ترانسفيراز HaeIII بالحرارة؟ ج: نعم. عطّله عند درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. س: هل يتطلب إنزيم ميثيل ترانسفيراز HaeIII وجود MgCl2؟ ج: لا. س: ما هو الوزن الجزيئي لإنزيم ميثيل ترانسفيراز HaeIII؟ ج: الوزن الجزيئي هو 37,684 دالتون. س: هل تعمل أي من إنزيمات ميثيل ترانسفيراز (ميثيلاز) من شركة NEB على الحمض النووي الريبي (RNA)؟ ج: نعم، ينتج إنزيم ميثيل ترانسفيراز EcoGII (NEB #M0603) ما بين 5-10% من بقايا الأدينوزين الميثيلية على ركائز الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، لا تفعل إنزيمات ميثيل ترانسفيراز الأخرى ذلك. يرجى الملاحظة: قامت شركة NEB باختبار ناقلات/ميثيلازات (MT) التالية: ناقل ميثيل dam (NEB #M0222)، ناقل ميثيل AluI (NEB #M0220)، ناقل ميثيل BamHI (NEB #M0223)، ناقل ميثيل M.SssI (NEB #M0226)، ناقل ميثيل EcoRI (NEB #M0211)، ناقل ميثيل M.CviPI (NEB #M0227)، ناقل ميثيل HaeIII (NEB #M0224)، ناقل ميثيل HhaI (NEB #M0217)، ناقل ميثيل HpaII (NEB #M0214)، ناقل ميثيل MspI (NEB #M0215) وناقل ميثيل TaqI (NEB #M0219) باستخدام محاليل التفاعل المرفقة على ركيزتين: 1) تم استخدام 1) mRNA مُستنسخ في المختبر يُشفّر إنزيم لوسيفيراز اليراعة (1 ميكروغرام) و2) RNA الكلي من خلايا هيلا (250 نانوغرام). حُضنت كل ركيزة مع كميتين من الإنزيم (1 و5 ميكرولتر) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية (65 درجة مئوية لإنزيم Taq I MT)، ثم نُقّيت باستخدام عمود طرد مركزي، وهُضمت إلى نيوكليوسيدات منفردة باستخدام مزيج من الإنزيمات، وحُللت بتقنية LC/MS لتحديد البقايا المُعدّلة وغير المُعدّلة. لم يتمكن أي من إنزيمات الميثيلاز التي تم فحصها من نقل مجموعة ميثيل إلى ركائز RNA المدروسة.