مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، M0226L، ناقل ميثيل CpG (M.SssI)

الفئات ذات الصلة: إنزيمات التقييد الحساسة للمثيلة والمعتمدة على المثيلة لعلم التخلق، ناقلات المثيلة لعلم التخلق، إنزيمات تعديل القواعد. تعريف الوحدة: تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لحماية 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية من الانقسام بواسطة إنزيم التقييد BstUI. شروط التفاعل: محلول NEBuffer™ 2 بتركيز 1X، مضاف إليه 160 ميكرومول من S-أدينوسيل ميثيونين (SAM)، يُحضن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. محلول NEBuffer™ 2 بتركيز 1X، 50 ملي مول من كلوريد الصوديوم، 10 ملي مول من Tris-HCl، 10 ملي مول من كلوريد المغنيسيوم، 1 ملي مول من DTT (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). اختبار الحماية الضابط: تفاعل بحجم 20 ميكرولتر في محلول NEBuffer 2 يحتوي على 1 ميكروغرام من حمض لامدا النووي، مضاف إليه 160 ميكرومول من SAM ووحدة واحدة من M.Sss I، يُحضن لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، ثم يُعطل بالحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ينتج عنه حماية بنسبة 95% من الهضم باستخدام 10 وحدات من BstU I في محلول rCutSmart، يُحضن عند درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، كما تم تحديده بواسطة الترحيل الكهربائي على هلام الأغاروز. محلول التخزين : 10 ملي مولار Tris-HCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، 200 ميكروغرام/مل BSA، درجة الحموضة 7.4 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. الأسئلة الشائعة : س: هل يُرفق S-أدينوسيل ميثيونين (SAM) مع إنزيم ميثيل ترانسفيراز؟ ج: نعم، يُرفق محلول مركز بتركيز 32 ملي مولار. يمكن طلبه بشكل منفصل كمنتج رقم NEB# B9003S. يُعد SAM المكون الأكثر حساسية في التفاعل. يجب استبدال المحلول المركز إذا كان عمره أكثر من 9 أشهر. س: ما الذي يجب مراعاته إذا لم يكتمل تفاعل الميثيل باستخدام إنزيم SssI ميثيل ترانسفيراز؟ ج: يُعد SAM المكون الأكثر حساسية في التفاعل. يجب استبدال المحلول المركز إذا كان عمره أكثر من 6 أشهر. إذا كانت كمية الحمض النووي المراد مثيلته تزيد عن 1 ميكروغرام، فقم بزيادة تركيز SAM من 160 ميكرومولار الموصى به إلى 640 ميكرومولار. يمكن مثيلة 4 ميكروغرام كحد أقصى لكل 20 ميكرولتر من التفاعل باستخدام 640 ميكرومولار من SAM. استخدم 2-4 وحدات لكل ميكروغرام. استخدم إنزيم SssI M0226M المركز للحفاظ على تركيز الجلسرين منخفضًا. زد مدة التفاعل إلى 4 ساعات. نظرًا لعدم استقرار SAM ولأن الناتج الثانوي للتفاعل (S-أدينوسيل هوموسيستين) مثبط، لا يُنصح بإجراء تفاعلات طوال الليل. نظف الحمض النووي. أزل بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وجزيئات الحمض النووي الصغيرة الأخرى باستخدام عمود طرد مركزي أو إجراء مشابه. قم بغسل العينة بالترشيح لإزالة الأملاح. س: ما هو نشاط إنزيم SssI ميثيل ترانسفيراز في محاليل NEBuffers الأخرى، بما في ذلك rCutSmart؟ ج: تبلغ نسبة النشاط 25% في محلول NEBuffer 3 و10% في محلولي NEBuffer 1 و4. ويمكن استخدامه أيضًا في محلول rCutsmart. للاطلاع على نسبة نشاطه الوظيفي في rCutsmart، ونسبة نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي الأخرى في عملية الاستنساخ، يُرجى الرجوع إلى مخطط نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي في محلول rCutSmart®. س: هل يمكن لإنزيم SssI ميثيل ترانسفيراز مثيلة الحمض النووي أحادي السلسلة؟ ج: لا. س: هل يمكن استخدام إنزيم SssI ميثيل ترانسفيراز لإنتاج عينة تحكم موجبة لتفاعل البلمرة المتسلسل الخاص بالمثيلة أو تسلسل البيسلفات؟ ج: نعم، يمكن استخدام SssI لإنتاج عينة تحكم موجبة لهذه العملية. نقترح استخدام 4 وحدات لكل ميكروغرام من الحمض النووي لمدة ساعتين. يُستخدم البيسلفات لتحويل السيتوزين غير المُمَثْيَل إلى ثايمين، تاركًا السيتوزين المُمَثْيَل على هيئة سيتوزين في الحمض النووي الركيزة. تُستخدم عينة من الركيزة المُعدلة وغير المُعدلة في تفاعل البلمرة المتسلسل. تشير الاختلافات الملحوظة في تسلسل نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) إلى وجود مناطق مثيلة مقابل مناطق غير مثيلة (1). (1) Frommer, M. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) Vol. 89, pp1827-1831. س: ما هو النشاط النوعي لإنزيم SssI ميثيل ترانسفيراز؟ ج: يبلغ النشاط النوعي حوالي 41000 وحدة/ملغ. س: هل يتطلب إنزيم SssI ميثيل ترانسفيراز وجود المغنيسيوم في المحلول المنظم؟ ج: لا. بوجود المغنيسيوم، يكون تفاعل الإنزيم توزيعيًا، ويُظهر الإنزيم نشاط توبويزوميراز. بدون المغنيسيوم، يكون التفاعل متتابعًا (2). (2) Matsuo et al, Nucl. Acids Res. (1994) Vol 22, 5354-5359. س: هل يمكن وسم الحمض النووي (DNA) إشعاعيًا باستخدام إنزيم SssI ميثيل ترانسفيراز؟ ج: نعم. انقر هنا للاطلاع على البروتوكول الكامل. س: هل يمكن استخدام الحمض النووي الميثيلي بواسطة SssI لتحويل بكتيريا الإشريكية القولونية؟ ج: الحمض النووي الميثيلي بواسطة SssI حساس لـ mcr. يجب استخدام سلالة من الإشريكية القولونية تفتقر إلى mcrA و mcrBC و Mrr وإلا سيتحلل الحمض النووي. س: ما هو الوزن الجزيئي لإنزيم SssI (CpG) ميثيل ترانسفيراز؟ ج: الوزن الجزيئي 42000 دالتون. س: هل تعمل أي من إنزيمات ميثيل ترانسفيراز (ميثيلاز) من شركة NEB على الحمض النووي الريبي (RNA)؟ ج: نعم، ينتج إنزيم EcoGII ميثيل ترانسفيراز (NEB #M0603) ما بين 5-10% من بقايا الأدينوزين الميثيلية على ركائز الحمض النووي الريبي. مع ذلك، لا تفعل إنزيمات الميثيل ترانسفيراز الأخرى ذلك. يرجى الملاحظة: قامت شركة NEB باختبار ناقلات/ميثيلازات (MT) التالية: ناقل ميثيل dam (NEB #M0222)، ناقل ميثيل AluI (NEB #M0220)، ناقل ميثيل BamHI (NEB #M0223)، ناقل ميثيل M.SssI (NEB #M0226)، ناقل ميثيل EcoRI (NEB #M0211)، ناقل ميثيل M.CviPI (NEB #M0227)، ناقل ميثيل HaeIII (NEB #M0224)، ناقل ميثيل HhaI (NEB #M0217)، ناقل ميثيل HpaII (NEB #M0214)، ناقل ميثيل MspI (NEB #M0215) وناقل ميثيل TaqI (NEB #M0219) باستخدام محاليل التفاعل المرفقة على ركيزتين: 1) تم استخدام 1) mRNA مُستنسخ في المختبر يُشفّر إنزيم لوسيفيراز اليراعة (1 ميكروغرام) و2) RNA الكلي من خلايا هيلا (250 نانوغرام). حُضنت كل ركيزة مع كميتين من الإنزيم (1 و5 ميكرولتر) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية (65 درجة مئوية لإنزيم Taq I MT)، ثم نُقّيت باستخدام عمود طرد مركزي، وهُضمت إلى نيوكليوسيدات منفردة باستخدام مزيج من الإنزيمات، وحُللت بتقنية LC/MS لتحديد البقايا المُعدّلة وغير المُعدّلة. لم يتمكن أي من إنزيمات الميثيلاز التي تم فحصها من نقل مجموعة ميثيل إلى ركائز RNA المدروسة.