مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، M0227L، ناقل ميثيل GpC (M.CviPI)

الفئات ذات الصلة: ميثيل ترانسفيراز لعلم التخلق، تحليل الكروماتين، إنزيمات تعديل القواعد. تعريف الوحدة: تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لحماية 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ضد الانقسام بواسطة إنزيم القطع الداخلي HaeIII. شروط التفاعل: محلول تفاعل GC بتركيز 1X، مُضاف إليه 160 ميكرومول من S-أدينوسيل ميثيونين (SAM). يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول تفاعل GC بتركيز 1X، 50 ملي مول من كلوريد الصوديوم، 50 ملي مول من Tris-HCl، 10 ملي مول من DTT (الأس الهيدروجيني 8.5 عند 25 درجة مئوية). اختبار الحماية الضابط: يُحضن M.CviPI مع 1 ميكروغرام من DNA λ في 20 ميكرولتر من محلول تفاعل GC بتركيز 1X و160 ميكرومول من S-أدينوسيل ميثيونين، لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. يُحدد مدى الحماية بواسطة M.CviPI بإضافة 30 ميكرولتر من محلول NEBuffer 2 الذي يحتوي على 10 وحدات من إنزيم القطع HaeIII. يُحضن لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية، ثم يُحلل على هلام الأغاروز. محلول التخزين : 15 ملي مولار Tris-HCl، 0.2 مولار NaCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 200 ميكروغرام/مل BSA، 50% جلسرين، درجة الحموضة 7.4 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. الأسئلة الشائعة : س: هل يعمل إنزيم GpC ميثيل ترانسفيراز (M. CviPI) في محلول rCutSmart؟ ج: نعم، يعمل إنزيم GpC ميثيل ترانسفيراز (M. CviPI) في محلول rCutSmart بإضافة DTT. لمعرفة نسبة نشاطه الوظيفي في rCutSmart، ونسبة نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي الأخرى في عملية الاستنساخ، يُرجى الرجوع إلى مخطط نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي في محلول rCutSmart®. س: هل تعمل أي من إنزيمات NEB ميثيل ترانسفيراز (ميثيلاز) على الحمض النووي الريبوزي (RNA)؟ ج: نعم، ينتج إنزيم ميثيل ترانسفيراز EcoGII (NEB #M0603) ما بين 5-10% من بقايا الأدينوزين الميثيلية على ركائز الحمض النووي الريبي. مع ذلك، لا تنتج إنزيمات ميثيل ترانسفيراز الأخرى هذه البقايا. يرجى الملاحظة: قامت شركة NEB باختبار ناقلات/ميثيلازات (MT) التالية: ناقل ميثيل dam (NEB #M0222)، ناقل ميثيل AluI (NEB #M0220)، ناقل ميثيل BamHI (NEB #M0223)، ناقل ميثيل M.SssI (NEB #M0226)، ناقل ميثيل EcoRI (NEB #M0211)، ناقل ميثيل M.CviPI (NEB #M0227)، ناقل ميثيل HaeIII (NEB #M0224)، ناقل ميثيل HhaI (NEB #M0217)، ناقل ميثيل HpaII (NEB #M0214)، ناقل ميثيل MspI (NEB #M0215) وناقل ميثيل TaqI (NEB #M0219) باستخدام محاليل التفاعل المرفقة على ركيزتين: 1) تم استخدام 1) mRNA مُستنسخ في المختبر يُشفّر إنزيم لوسيفيراز اليراعة (1 ميكروغرام) و2) RNA الكلي من خلايا هيلا (250 نانوغرام). حُضنت كل ركيزة مع كميتين من الإنزيم (1 و5 ميكرولتر) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية (65 درجة مئوية لإنزيم Taq I MT)، ثم نُقّيت باستخدام عمود طرد مركزي، وهُضمت إلى نيوكليوسيدات منفردة باستخدام مزيج من الإنزيمات، وحُللت بتقنية LC/MS لتحديد البقايا المُعدّلة وغير المُعدّلة. لم يتمكن أي من إنزيمات الميثيلاز التي تم فحصها من نقل مجموعة ميثيل إلى ركائز RNA المدروسة.