نيو إنجلاند بيولابس، M0238S، 9°N™ DNA Ligase

تمت إعادة صياغة إنزيم ربط الحمض النووي 9°N باستخدام الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10230152. التصنيفات ذات الصلة: إنزيمات ربط الحمض النووي ، التطبيقات ، الاستنساخ، مواصفات الربط، تعريف الوحدة (وحدة الطرف المتماسك): تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لربط 50% من الأطراف المتماسكة المكونة من 12 زوجًا قاعديًا لـ 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ المُهضَّم بواسطة إنزيم BstEII في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر خلال 15 دقيقة عند درجة حرارة 45 درجة مئوية. وحدة الطرف المتماسك تُعادل وحدة إغلاق الشق (1). شروط التفاعل: محلول تفاعل إنزيم ربط الحمض النووي 9°N بتركيز 1X، يُحضن عند 45 درجة مئوية. محلول تفاعل إنزيم ربط الحمض النووي 9°N بتركيز 1X، 10 ملي مولار Tris-HCl، 600 ميكرومولار ATP، 2.5 ملي مولار DTT، 2.5 ملي مولار MgCl2، 0.1% Triton® X-100 (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). تركيز الاستخدام: 40,000 وحدة/مل. محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 200 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، 10 ملي مولار كبريتات الأمونيوم، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: لا يوجد. شروط فحص الوحدة: محلول تفاعل إنزيم ربط الحمض النووي 9°N بتركيز 1X و20 ميكروغرام/مل من إنزيم BstEII المُهضّم يُحضّر الحمض النووي λ في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر. بعد التحضين عند 45 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، يُوقف التفاعل بإضافة صبغة الإيقاف (50% جلسرين، 50 ملي مولار EDTA، وأزرق بروموفينول)، ثم يُسخّن عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ويُحمّل بعد ذلك على هلام أجاروز بنسبة 0.7%. بفضل وجود الليغاز، تبقى نهايات cos للحمض النووي λ المُهضّم بواسطة BstEII متصلة بعد المعالجة الحرارية عند 70 درجة مئوية. الأسئلة الشائعة : س: ما هو تفاعل سلسلة الليغاز (LCR) وما هي الإنزيمات التي توصون بها؟ ج: تفاعل سلسلة الليغاز (LCR) هو طريقة مشابهة لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم الحمض النووي، وله تطبيقات تشخيصية واعدة. يعتمد تفاعل سلسلة الليغاز على الربط، ويمكنه التمييز بين تسلسلات الحمض النووي التي تختلف في نيوكليوتيد واحد فقط (تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة). تُستخدم أربعة مجسات في تفاعل ربط الحمض النووي المتسلسل (LCR)، زوج واحد مكمل لكل سلسلة في التسلسل المستهدف، مع وجود نقطة الربط عند تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP) المراد تمييزها. تستخدم هذه الطريقة إنزيمات ربط الحمض النووي المقاومة للحرارة، مثل إنزيم Taq DNA Ligase (NEB #M0208) وإنزيم 9°N™ DNA Ligase (NEB #M0238). لمزيد من المعلومات حول خصوصية إنزيمات الربط وإنزيمات الربط عالية الدقة، يُرجى زيارة "خصوصية الركيزة والتمييز بين عدم التطابق في إنزيمات ربط الحمض النووي". س: ما هو تفاعل الكشف عن الربط (LDR) وكيف يختلف عن تفاعل ربط الحمض النووي المتسلسل (LCR)؟ ج: تفاعل الكشف عن الربط (LDR) هو منهجية تعتمد على الربط، وعلى عكس تفاعل ربط الحمض النووي المتسلسل (LCR)، فإنه يتضمن زوجًا واحدًا فقط من المجسات المكملة لسلسلة واحدة من الحمض النووي المستهدف. ينتج عن تكرار تفاعل الكشف عن الربط (LDR) تضخيم خطي لناتج الربط. يمكن استخدام هذه الطريقة لتأكيد وجود تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP) معين في تسلسل مستهدف تم تضخيمه بطريقة أخرى (مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل PCR). كما هو الحال مع تفاعل ربط الليغاز المتسلسل (LCR)، تستخدم هذه الطريقة إنزيم ربط عالي الدقة ومستقر حراريًا، قادر على التمييز ضد ربط المجسات غير المتطابقة، مثل إنزيم ربط الحمض النووي Taq (NEB #M0208) وإنزيم ربط الحمض النووي 9°N™ (NEB #M0238). لمزيد من المعلومات حول خصوصية إنزيم الربط وإنزيمات الربط عالية الدقة، يُرجى زيارة "خصوصية الركيزة والتمييز بين عدم التطابق في إنزيمات ربط الحمض النووي". س: كيف يُمكنني تصميم مجسات لتفاعل الكشف عن الليغاز (LDR) أو تفاعل ربط الليغاز المتسلسل (LCR) لزيادة الخصوصية إلى أقصى حد؟ ج: يجب تصميم مجسات تفاعل الكشف عن الليغاز (LDR) وتفاعل ربط الليغاز المتسلسل (LCR) بحيث تتحد جميعها ضمن نطاق حراري ضيق (مثاليًا أقل من 2 درجة مئوية)، ويجب أن تحتوي على مناطق اندماج يتراوح طولها بين 15 و30 قاعدة. عادةً، تكون درجة حرارة التفاعل المثلى للحصول على أعلى دقة تقريبًا بين درجتين مئويتين أقل ودرجتين مئويتين أعلى من درجة انصهار الليغاز (Tm) لمجموعة مجسات معينة، ويتم حسابها وفقًا لظروف المحلول المنظم المستخدم. يُنصح بشدة باستخدام حاسبة درجة حرارة تفاعل الليغاز المقاوم للحرارة لاختيار درجة حرارة الحضانة. مع ذلك، يجب تحديد درجة حرارة التفاعل المثلى لمجموعة مجسات معينة تجريبيًا. عند استخدام إنزيم HiFi Taq DNA Ligase، يمكن أن يرتبط النيوكليوتيد المفرد المتغير (SNP) المراد تمييزه إما بالقاعدة 3' للمجس العلوي (موفرًا مجموعة الهيدروكسيل 3' لوصلة الربط) أو بالقاعدة 5' للمجس السفلي (موفرًا مجموعة الفوسفات 5' لوصلة الربط)، حيث يُظهر إنزيم HiFi Taq DNA Ligase تمييزًا مُحسَّنًا بين أزواج القواعد الصحيحة وغير الصحيحة على جانبي وصلة الربط. يُرجى الاطلاع على معلومات المنتج المرفقة لتحليل مُفصَّل لدقة ربط عدم التطابق بواسطة إنزيم HiFi Taq DNA Ligase، والذي يُوضح دقته العالية على جانبي وصلة الربط 3' و5'، بالإضافة إلى نسب تمييز أزواج القواعد المُحددة. للحصول على مزيد من المعلومات حول خصوصية الليغازات وليغازات الدقة العالية، يُرجى زيارة "خصوصية الركيزة والتمييز بين عدم التطابق في ليغازات الحمض النووي". سؤال: هل تقوم ليغازات الحمض النووي المقاومة للحرارة (مثل Taq DNA Ligase و9°N DNA Ligase وHiFi Taq DNA Ligase) بربط النهايات اللزجة؟ جواب: على الرغم من قدرة هذه الليغازات المقاومة للحرارة على ربط النهايات اللزجة ذات التداخل الواسع، مثل النهايات المتماسكة ذات 12 زوجًا قاعديًا في جينوم العاثية لامدا، إلا أن النهايات البارزة النموذجية ذات 4 أزواج قاعدية الناتجة عن إنزيمات التقييد من النوع الثاني لا تُعد ركائز جيدة ولن يتم ربطها. لا يُنصح باستخدام ليغازات الحمض النووي المقاومة للحرارة في عمليات الاستنساخ التقليدية.