نيو إنجلاند بيولابس، M0251L، بوليميراز الحمض النووي الريبي T7

الفئات ذات الصلة: تخليق الحمض النووي الريبي، النسخ في المختبر (IVT)، محاليل النيوكليوتيدات لتطبيقات الحمض النووي الريبي، التضخيم بوساطة النسخ وتضخيم NASBA. المواصفات: المواد المطلوبة ولكن غير المرفقة: مثبط RNase، فأري (NEB #M0314) (اختياري)، مزيج محلول الريبونوكليوتيد (NEB #N0466)، DTT طازج (اختياري)، ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500). تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي ستدمج 1 نانومول من ATP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل RNAPol بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول تفاعل RNAPol بتركيز 1X: 40 ملي مولار Tris-HCl، 6 ملي مولار MgCl2، 1 ملي مولار DTT، 2 ملي مولار سبيرميدين (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 50 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار NaCl، 20 ملي مولار β-ME، 1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، 0.1% (وزن/حجم) Triton® X-100، الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية. شروط فحص الوحدة: محلول تفاعل RNAPol بتركيز 1X، مُضاف إليه 0.5 ملي مولار من كل من ATP وUTP وGTP وCTP، و1 ميكروغرام من حمض T7 DNA في 50 ميكرولتر. الأسئلة الشائعة : س: ما هو تسلسل المحفز لإنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي T7؟ ج: مُحفِّز T7 5′ TAATACGACTCACTATAG 3′ يبدأ بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 عملية النسخ عند النيوكليوتيد G المُسطَّر في تسلسل المُحفِّز. ثم يقوم البوليميراز بالنسخ باستخدام الشريط المقابل كقالب من 5′ إلى 3′. ستكون القاعدة الأولى في النسخة هي G. س: هل من الممكن بدء النسخ بالنيوكليوتيد A؟ ج: يمكن لبوليميراز الحمض النووي الريبي T7 بدء النسخ بالنيوكليوتيد A تحت مُحفِّز T7 من الفئة الثانية. على غرار مُحفِّز T7 العادي، يُفضَّل وجود النيوكليوتيد G في الموضعين الثاني والثالث. مُحفِّز T7 من الفئة الثانية 5′- TAATACGACTCACTATTA 3′ س: هل يتطلب تفاعل النسخ باستخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 بادئًا؟ ج: لا، يتعرف بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 على تسلسل المُحفِّز الخاص به ويبدأ النسخ عند النيوكليوتيد G الأخير. ثم يقوم البوليميراز بالنسخ باستخدام الشريط المقابل كقالب من 5′ إلى 3′. س: هل يترك إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 قاعدة إضافية في نهاية النسخة؟ ج: نعم، يمكن لإنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 إضافة قاعدة أو بضع قواعد إضافية في نهاية النسخة، مما ينتج عنه مجموعة من النسخ ذات نهايات 3' غير متجانسة. س: هل يعمل إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 على ركيزة أحادية السلسلة؟ ج: لا، يجب أن تكون منطقة تسلسل المحفز ثنائية السلسلة. س: هل يعمل إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 على الحمض النووي البلازميدي غير المقطوع؟ ج: نعم، ولكن إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 هو إنزيم شديد التكرار، وسيستمر في النسخ حول قالب دائري عدة مرات دون أن ينفصل. يمكن تحويل البلازميد إلى شكل خطي باستخدام إنزيم تقييد يترك طرفًا غير لاصق أو نتوءًا 5' في اتجاه مجرى الحمض النووي المطلوب. س: هل يمكن إنتاج حمض نووي ريبي شاذ عند استخدام إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي T7؟ ج: لوحظ وجود RNA شاذ عندما ينتج عن إنزيم التقييد المستخدم لتخطيط البلازميد أسفل DNA المطلوب نتوء 3'. لتجنب ذلك، يجب قطع البلازميد بإنزيم تقييد يترك نتوءًا غير لاصق أو نتوء 5' أسفل DNA المطلوب. س: هل يمكنني استخدام بوليميراز RNA T7 لصنع مجسات مشعة عالية النشاط النوعي؟ ج: نعم، يمكن استخدام بوليميراز RNA T7، وبوليميراز RNA SP6، وبوليميراز RNA T3، ومجموعة HiScribe T7 (NEB #E2040) لصنع مجسات RNA. يمكن الحصول على حساسية كشف أعلى للأحماض النووية باستخدام مجس RNA نظرًا لاستقرار هجائن RNA/DNA بشكل أكبر من هجائن DNA/DNA. س: ما هي الأسباب الرئيسية لفشل التفاعل باستخدام بوليميراز RNA T7؟ ج: بوليميراز RNA T7 حساس للغاية لتثبيط الأملاح. يجب ألا يتجاوز تركيز الملح أحادي التكافؤ 20 ملي مولار. يجب تحضير قالب الحمض النووي DNA خاليًا من الأملاح. يؤدي تلوث الحمض النووي الريبوزي RNase إلى تحلل منتج الحمض النووي الريبوزي RNA. نوصي باستخدام مثبط RNase (NEB #0314 أو #M0307) في التفاعل بتركيز وحدة واحدة/ميكرولتر. استخدم ماءً فائق النقاء وتأكد من استخلاص قالب الحمض النووي DNA باستخدام الفينول/الكلوروفورم. س: لماذا النشاط النوعي للمسبار منخفض؟ ج: يجب أن يكون تركيز النيوكليوتيد المشع محدودًا (6 ميكرومول). بمعنى آخر، عند استخدام ATP موسوم، أضف 500 ميكرومول من UTP وCTP وGTP، ولكن أضف 6 ميكرومول فقط من ATP في عملية النسخ، بحيث يتم دمج ATP بنسبة أعلى، مما ينتج عنه مسبار RNA عالي النشاط. س: كيف يمكن زيادة إنتاجية الحمض النووي الريبوزي RNA إلى أقصى حد عند استخدام بوليميراز T7 RNA؟ ج: يمكن الحصول على إنتاجية أعلى من الحمض النووي الريبوزي RNA عن طريق زيادة تركيزات النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (NTP)، وكمية قالب الحمض النووي DNA، وكمية بوليميراز T7 RNA. تم تحسين مجموعات HiScribe T7 من NEB لتخليق كميات كبيرة من الحمض النووي الريبوزي (RNA) غير المعدل، بالإضافة إلى الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) المُغطى والمُذيل. يُرجى مراجعة صفحات المنتج للاطلاع على التفاصيل. E2040: مجموعة HiScribe® T7 لتخليق الحمض النووي الريبوزي (RNA) عالي الإنتاجية. E2050: مجموعة HiScribe® T7 لتخليق الحمض النووي الريبوزي (RNA) سريع وعالي الإنتاجية. E2060: مجموعة HiScribe® T7 ARCA mRNA (مع إضافة ذيل). E2065: مجموعة HiScribe® T7 ARCA mRNA. E2080: مجموعة HiScribe® T7 mRNA مع كاشف CleanCap® AG.