مختبرات نيو إنجلاند بيولابس، M0253S، إنزيم النسخ العكسي M-MuLV

يقوم إنزيم النسخ العكسي M-MuLV بتخليق سلسلة DNA مكملة تبدأ من بادئ باستخدام إما RNA (تخليق cDNA) أو DNA أحادي السلسلة كقالب. الفئات ذات الصلة: تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR)، وتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA)، وإنزيمات النسخ العكسي. التطبيقات: تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA)، والنسخ العكسي (تخليق الحمض النووي المكمل)، وتفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) وتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA). المواصفات: المواد المطلوبة (غير متوفرة ): مثبط إنزيم RNase، فأري (NEB #M0314)، ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500). تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي تُدمج 1 نانومول من dTTP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر خلال 10 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية باستخدام poly(rA) - oligo(dT) كبادئ قالب مع 50 ملي مولار من Tris-HCl (الأس الهيدروجيني 8.3)، و6 ملي مولار من MgCl2، و10 ملي مولار من ثنائي ثيوتريتول، و0.5 ملي مولار من [3H]-dTTP، و0.4 ملي مولار من [3H]-dTTP. بولي(rA) - أوليجو(dT)12-18. شروط التفاعل: محلول تفاعل النسخ العكسي M-MuLV بتركيز 1X، يُحضن عند 42 درجة مئوية. محلول تفاعل النسخ العكسي M-MuLV بتركيز 1X: 50 ملي مولار Tris-HCl، 75 ملي مولار KCl، 3 ملي مولار MgCl2، 10 ملي مولار DTT (الأس الهيدروجيني 8.3 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 50 ملي مولار Tris-HCl، 150 ملي مولار NaCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، 0.1% NP-40، الأس الهيدروجيني 7.6 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. الوزن الجزيئي النظري: 78000 دالتون. الأسئلة الشائعة : س: هل يمكن استخدام إنزيم النسخ العكسي M-MuLV في محاليل NEBuffers أخرى؟ ج: يُلاحظ النشاط الأمثل في محلوله الخاص. يُعطي محلول NEBuffer 2 نشاطًا بنسبة 50% تقريبًا. ويُلاحظ النشاط الأمثل عند تركيز أيونات المغنيسيوم (Mg2+) 3 ملي مولار. عند تركيز 10 ملي مولار من أيونات المغنيسيوم، ينخفض ​​النشاط إلى 60%. ويُعدّ التركيز الأمثل للملح حوالي 75 ملي مولار (1). (1) جيرارد جي إف، ود' أليسيو جي إم، الفصل 6 (73-93) من: طرق في البيولوجيا الجزيئية، المجلد 16: إنزيمات البيولوجيا الجزيئية، تحرير: إم إم بوريل، 1993، دار هومانا للنشر، توتوا، نيوجيرسي. س: هل يتطلب إنزيم النسخ العكسي M-MuLV ثنائي ثيوثريتول (DTT)؟ ج: نعم (1). (1) جيرارد جي إف، ودي أليسيو جي إم، الفصل 6 (73-93) من: طرق في البيولوجيا الجزيئية، المجلد 16: إنزيمات البيولوجيا الجزيئية، تحرير: إم إم بوريل، 1993، دار هومانا للنشر، توتوا، نيوجيرسي. س: هل يستطيع إنزيم النسخ العكسي M-MuLV النسخ عبر وصلات الحمض النووي الريبي-الحمض النووي؟ ج: نعم. إنزيم النسخ العكسي M-MuLV قادر على النسخ عبر وصلات الحمض النووي الريبي-الحمض النووي. س: كيف يمكن زيادة طول الناتج الناتج عن إنزيم النسخ العكسي M-MuLV؟ ج: يمكن أن يؤدي الحضانة عند 42 درجة مئوية إلى إرخاء بعض البنية الثانوية للحمض النووي الريبي، مما يسمح لإنزيم النسخ العكسي M-MuLV بإنتاج نواتج أطول. س: كيف يمكن تحسين المردود عند استخدام إنزيم النسخ العكسي M-MuLV؟ ج: يُعد تجنب تلوث الريبونوكلياز أمرًا بالغ الأهمية، نظرًا لضرورة استخدام قالب حمض نووي ريبي عالي الجودة. تتضمن مجموعة ProtoScript لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من السلسلة الأولى (NEB# E6500) مثبطًا لإنزيم RNase. س: ما هي بعض أسباب فشل تفاعل النسخ العكسي لإنزيم M-MuLV؟ ج: قد يؤدي استخدام SDS أو DMSO أو تركيز عالٍ من الملح أو EDTA في تحضير قالب الحمض النووي إلى تثبيط التفاعل. يُعد إنزيم M-MuLV للنسخ العكسي حساسًا بشكل خاص لتأثيرات التخليب لـ EDTA، حيث أن تركيز Mg2+ الأمثل هو 3 ملي مولار. تستخدم تقنيات البيولوجيا الجزيئية الأخرى عادةً 10 ملي مولار من Mg2+، لذا فهي أكثر قدرة على تحمل آثار EDTA. س: هل يكون إنزيم M-MuLV للنسخ العكسي نشطًا عند درجات حرارة أعلى من 42 درجة مئوية؟ ج: بالنسبة لقوالب معينة صعبة (مثل تلك التي تحتوي على نسبة عالية من GC أو بنية ثانوية كبيرة)، يمكن استخدام درجة حرارة تفاعل أعلى، ولكن قد ينخفض ​​إجمالي إنتاج الحمض النووي. لقد نجحنا في نسخ رسائل بحجم 6 كيلوبايت عن طريق النسخ العكسي عند 55 درجة مئوية. س: هل يمكن استخدام الحمض النووي كقالب لإنزيم النسخ العكسي M-MuLV؟ ج: نعم، ولكن التفاعل يكون أقل كفاءة (1). (1) جيرارد جي إف، ودي أليسيو جي إم، الفصل 6 (73-93) من: طرق في البيولوجيا الجزيئية، المجلد 16: إنزيمات البيولوجيا الجزيئية، تحرير: إم إم بوريل، 1993، دار هومانا للنشر، توتوا، نيوجيرسي. س: هل تُزوَّد بوليميرازات الحمض النووي من شركة NEB مع النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs)؟ ج: لا، يجب طلب النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs) بشكل منفصل. يمكن طلبها كمزيج جاهز (مزيج محلول ديوكسي نيوكليوتيد (dNTP) (NEB# N0447) بتركيز 10 ملي مولار لكل ديوكسي نيوكليوتيد) أو كمجموعة من 4 أنابيب فردية (مجموعة محلول ديوكسي نيوكليوتيد (dNTP) (NEB# N0446) بتركيز 100 ملي مولار لكل ديوكسي نيوكليوتيد).