نيو إنجلاند بيولابس، M0254L، بوليميراز الحمض النووي Vent®

فئات ذات صلة أخرى تطبيقات بوليميرازات تفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني، تعريف وحدة مواصفات تفاعل البوليميراز المتسلسل: تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي ستدمج 10 نانومول من dNTP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض في 30 دقيقة عند 75 درجة مئوية. شروط التفاعل : محلول تفاعل ThermoPol® بتركيز 1X، 20 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار (NH4)2SO4، 10 ملي مولار KCl، 2 ملي مولار MgSO4، 0.1% Triton® X-100 (الأس الهيدروجيني 8.8 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 0.1% Triton® X-100، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : لا. الوزن الجزيئي النظري: 89000 دالتون . إكسونوكلياز 3' - 5': نعم. إزاحة السلسلة +. شروط فحص الوحدة : محلول ThermoPol® بتركيز 1X، 200 ميكرومولار من كل نيوكليوتيد ثلاثي الفوسفات (dNTP) بما في ذلك [3H]-dTTP، 15 نانومولار من البادئ. الحمض النووي M13. معدل الخطأ < 57 × 10⁻⁶ قاعدة. الأسئلة الشائعة : س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Vent في محاليل منظمة أخرى؟ ج: لا يُنصح باستخدام محاليل منظمة أخرى. س: متى يُستخدم بوليميراز الحمض النووي Vent® في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)؟ ج: يُعد بوليميراز الحمض النووي Vent® خيارًا مثاليًا ومُثبتًا لتفاعل البلمرة المتسلسل الروتيني الفعال من حيث التكلفة، حيث تكون المنتجات عالية الدقة ضرورية. س: يُنتج بوليميراز الحمض النووي Vent وبوليميراز الحمض النووي Deep Vent نهايات حمض نووي غير لاصقة، ولكن استنساخي يعتمد على أن يكون لمنتج تمديد البادئ قاعدة أدينين واحدة بارزة في الطرف 3'. ج: عالج منتجات النهايات غير اللاصقة باستخدام بوليميراز الحمض النووي Taq (NEB #M0267، NEB #M0273). بعد تمديد البادئ باستخدام بوليميراز الحمض النووي Vent، استخلص الحمض النووي باستخدام الفينول:الكلوروفورم، ثم قم بترسيبه باستخدام حجمين من الإيزوبروبانول. أعد تعليق المحلول في محلول تفاعل ThermoPol بتركيز 1X، وأضف وحدة واحدة من إنزيم Taq DNA بوليميراز و200 ميكرومول من dATP؛ امزج جيدًا وحضّن عند 72 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. س: لا يعمل إنزيم Vent DNA بوليميراز، بينما يعمل إنزيم Taq DNA بوليميراز بشكل جيد. ج: إنزيمات DNA بوليميراز التي تتميز بدقة عالية بفضل وجود جزء إكسونوكلياز مصحح، تتطلب دقة أكبر في استخدامها من مشتقاتها الخارجية أو إنزيمات DNA بوليميراز التي لا تحتوي على إكسونوكلياز مصحح، مثل إنزيم Taq DNA بوليميراز. كما أن الاختلافات في قيمة Km (DNA) بين إنزيمات DNA بوليميراز المختلفة قد تُغير درجة حرارة ارتباط البادئ الفعالة. نقترح مراجعة الإرشادات العامة المرفقة مع إنزيم البوليميراز والالتزام بالاقتراحات التالية: 1. استخدم المحلول المرفق مع إنزيم البوليميراز. 2. استخدم النيوكليوتيدات الأربعة القياسية (dNTPs) (وليس dUTP أو dITP). 3. يبيع بعض موردي dNTPs مخزونات ملوثة بـ dUTP، مما قد يُسبب مشاكل مع بوليميرازات الحمض النووي المقاومة للحرارة. لتجنب التلوث، نقترح استخدام dNTPs من NEB. 4. اضبط درجة حرارة التلدين لزوج البادئات. 5. اضبط مستوى المغنيسيوم (2، 4، 6 أو 8 ملي مولار). 6. اضبط كمية البوليميراز (0.25-2 وحدة لكل تفاعل للمصححين؛ 2-4 وحدات لكل تفاعل للأشكال الخارجية)؛ قم بزيادة أو تقليل الكمية حسب حجم التفاعل. يمكن الاطلاع على تفاصيل بروتوكولات التحسين في صفحة المرجع الفني العام للبوليميراز. س: هل قطع الحمض النووي الناتجة عن بوليميراز Vent DNA ذات نهايات غير لاصقة أم أنها تحتوي على قاعدة واحدة بارزة في النهاية 3' كما هو الحال في بوليميراز Taq DNA؟ ج: يُنتج بوليميراز Vent DNA أكثر من 95% من القطع ذات النهايات غير اللاصقة. تُشبه مشتقات الإكسو إنزيم بوليميراز الحمض النووي Taq من حيث وجود نوعين رئيسيين من النهايات؛ 70% منها ذات نهايات غير لاصقة، بينما 30% منها عبارة عن نهايات بارزة أحادية القاعدة في الطرف 3'. س: هل يُمكنني استخدام إنزيم بوليميراز الحمض النووي Vent لتلميع نهايات قطع الحمض النووي؟ ج: نعم، يُمكن استخدام إنزيمات بوليميراز الحمض النووي ذات نشاط التدقيق (إكسونوكلياز 3'→5') لملء النهايات البارزة في الطرف 5' وإزالة الامتداد في الطرف 3'. يُفضل استخدام إنزيم بوليميراز الحمض النووي I، الجزء الكبير (Klenow) (NEB# M0210) لأنه يعمل عند درجة حرارة 25 درجة مئوية، ويُمكن استخدامه في مجموعة متنوعة من المحاليل المنظمة، كما يُمكن تعطيله بالحرارة. س: أرغب في استنساخ منتجات امتداد البادئ المصنوعة باستخدام إنزيم بوليميراز الحمض النووي Vent أو إنزيم بوليميراز الحمض النووي Deep Vent. هل هناك بروتوكولات أفضل من غيرها؟ ج: تعتمد أفضل البروتوكولات على استنساخ النهايات غير اللاصقة في ناقل مُعالج بالفوسفاتاز. يجب أن يكون الجزء المُدخل مُنشطًا عند نهاياته 5' ما لم يتم تصنيع البادئ مع فوسفات 5'.