نيو إنجلاند بيولابس، M0257L، بوليميراز الحمض النووي Vent® (خارجي)

فئات ذات صلة أخرى تطبيقات بوليميرازات تفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني، تعريف وحدة مواصفات تفاعل البوليميراز المتسلسل: تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي ستدمج 10 نانومول من dNTP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض في 30 دقيقة عند 75 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل ThermoPol® بتركيز 1X، محلول تفاعل ThermoPol® بتركيز 1X، 20 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار (NH4)2SO4، 10 ملي مولار KCl، 2 ملي مولار MgSO4، 0.1% Triton® X-100 (الأس الهيدروجيني 8.8 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 0.1% Triton® X-100، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : لا. الوزن الجزيئي النظري: 89000 دالتون . إكسونوكلياز 5' - 3' : لا. إكسونوكلياز 3' - 5': لا. إزاحة السلسلة : +++. شروط فحص الوحدة: محلول تفاعل ThermoPol® بتركيز 1X، 200 ميكرومولار من كل dNTP بما في ذلك [3 [H]-dTTP، 15 نانومول من الحمض النووي M13 المُحفَّز. معدل الخطأ < 190 × 10⁻⁶ قاعدة. الأسئلة الشائعة : س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Vent (exo-) في محاليل منظمة أخرى؟ ج: لا يُنصح باستخدام محاليل منظمة أخرى. س: هل قطع الحمض النووي الناتجة عن بوليميراز الحمض النووي Vent (exo-) ذات نهايات غير لاصقة أم أنها تحتوي على قاعدة واحدة بارزة في الطرف 3' كما هو الحال في بوليميراز الحمض النووي Taq؟ ج: هناك نوعان رئيسيان من النهايات؛ 70% منها ذات نهايات غير لاصقة، بينما 30% منها ذات قاعدة واحدة بارزة في الطرف 3'. إذا كنت ترغب في الحصول على قطع ذات نهايات غير لاصقة بنسبة تزيد عن 95%، فاستخدم بوليميراز الحمض النووي المُصحِّح مثل بوليميراز الحمض النووي Vent (NEB# M0254). س: لا أستطيع تشغيل بوليميراز الحمض النووي Vent (exo-) حتى الآن، بينما يعمل بوليميراز الحمض النووي Taq بشكل جيد. أ: إن بوليميرازات الحمض النووي التي تتميز بدقة عالية بفضل وجود وحدة إكسونيوكلياز مصححة، تتطلب دقة أكبر في استخدامها من مشتقاتها الخارجية أو بوليميرازات الحمض النووي التي لا تحتوي على وحدة إكسونيوكلياز مصححة، مثل بوليميراز الحمض النووي Taq. كما أن الاختلافات في قيمة ثابت ميكايليس (Km) للحمض النووي بين بوليميرازات الحمض النووي المختلفة قد تُغير درجة حرارة التلدين الفعالة للبادئات. نقترح مراجعة الإرشادات العامة المرفقة مع البوليميراز والالتزام بالتوصيات التالية: 1. استخدم المحلول المنظم المرفق مع البوليميراز. 2. استخدم النيوكليوتيدات القياسية الأربعة (dNTPs) (وليس dUTP أو dITP). 3. يبيع بعض موردي النيوكليوتيدات مخزونًا ملوثًا بـ dUTP، مما قد يُسبب مشاكل مع بوليميرازات الحمض النووي المقاومة للحرارة. لتجنب التلوث، نقترح استخدام نيوكليوتيدات NEB. 4. اضبط درجة حرارة التلدين لزوج البادئات. 5. اضبط مستوى المغنيسيوم (2، 4، 6، أو 8 ملي مولار). ٦. حسّن كمية البوليميراز (١-٢ وحدة لكل ١٠٠ ميكرولتر من التفاعل للمصححين؛ ٢-٤ وحدات لكل ١٠٠ ميكرولتر من التفاعل للأشكال الخارجية)؛ قم بزيادة أو تقليل الكمية حسب حجم التفاعل. يمكن الاطلاع على تفاصيل بروتوكولات التحسين في تبويب البروتوكولات. س: ما الذي يجب مراعاته عند تصميم مجموعة من بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؟ ج: ١. تجنب التكامل بين البادئات لمنع تكوين ثنائيات البادئات. ٢. تجنب التكرارات المعكوسة (التكامل الذاتي). ٣. يجب أن يكون محتوى GC للبادئ حوالي ٥٠٪. ٤. تجنب وجود قواعد G وC في الطرف ٣' للبادئات. هناك العديد من برامج الحاسوب التي ستساعدك في تصميم زوج من البادئات، مثل Primer3. س: كيف يمكنني تسهيل تضخيم القوالب ذات هياكل الحلقة الدبوسية أو ذات محتوى GC العالي؟ ج: تم تطوير إنزيم بوليميراز الحمض النووي OneTaq® (NEB# M0480، NEB# M0481) باستخدام مُخفِّف GC ومُحسِّن عالي GC، مما يُساعد على تضخيم القوالب الصعبة. أما إنزيم بوليميراز الحمض النووي Q5® عالي الدقة، فيأتي مزودًا بمُخفِّفات ومُحسِّن عالي GC، وقد تم تحسينه لتضخيم قوي، بغض النظر عن محتوى GC. يُمكنك أيضًا تجربة 7-ديأزا-dGTP مع dGTP العادي لزعزعة استقرار التراكيب الصعبة. ملاحظة: يُضعف 7-ديأزا-dGTP إشارة تلوين بروميد الإيثيديوم. OneTaq® وQ5® علامتان تجاريتان مسجلتان لشركة New England Biolabs, Inc.