نيو إنجلاند بيولابس، M0258L، بوليميراز الحمض النووي Deep Vent®

الفئات ذات الصلة تطبيقات بوليميرازات تفاعل البوليميراز المتسلسل الأخرى تفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني، تعريف وحدة PCR يتم تعريف الوحدة الواحدة على أنها كمية الإنزيم التي ستدمج 10 نانومول من dNTP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض في 30 دقيقة عند 75 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل ThermoPol® بتركيز 1X، محلول تفاعل ThermoPol® بتركيز 1X، 20 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار (NH4)2SO4، 10 ملي مولار KCl، 2 ملي مولار MgSO4، 0.1% Triton® X-100 (الأس الهيدروجيني 8.8 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، 0.1% Triton® X-100، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : لا. الوزن الجزيئي النظري: 89000 دالتون . إكسونوكلياز 5' - 3' : لا. إكسونوكلياز 3' - 5': نعم. إزاحة السلسلة : ++. شروط فحص الوحدة: محلول تفاعل ThermoPol® بتركيز 1X، 200 ميكرومولار لكل dNTP بما في ذلك [3 [H]-dTTP و15 نانومول من الحمض النووي M13 المُحفَّز. الأسئلة الشائعة: س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Deep Vent في محاليل منظمة أخرى؟ ج: لا يُنصح باستخدام محاليل منظمة أخرى. س: لا يعمل بوليميراز الحمض النووي Deep Vent لديّ، بينما يعمل بوليميراز الحمض النووي Taq بشكل جيد. ج: بوليميرازات الحمض النووي التي تتميز بدقة عالية بفضل جزء الإكسونوكلياز المُصحِّح، تتطلب دقة أكبر في استخدامها من مشتقاتها الخارجية أو بوليميرازات الحمض النووي التي لا تحتوي على إكسونوكلياز مُصحِّح، مثل بوليميراز الحمض النووي Taq. كما أن الاختلافات في قيمة Km (الحمض النووي) بين بوليميرازات الحمض النووي المختلفة قد تُغيِّر درجة حرارة ارتباط البادئ الفعالة. نقترح مراجعة الإرشادات العامة المُرفقة مع البوليميراز والالتزام بالاقتراحات التالية: 1. استخدم المحلول المنظم المُرفق مع البوليميراز. 2. استخدم النيوكليوتيدات الأربعة القياسية (dNTPs) (وليس dUTP أو dITP). ٣. يبيع بعض موردي dNTPs مخزونات ملوثة بـ dUTP، مما قد يُسبب مشاكل مع بوليميرازات الحمض النووي المقاومة للحرارة. لتجنب التلوث، نقترح استخدام dNTPs من NEB. ٤. اضبط درجة حرارة التلدين للبادئ. ٥. اضبط مستوى المغنيسيوم (٢، ٤، ٦، أو ٨ ملي مولار). ٦. اضبط كمية البوليميراز (٠.٢٥-٢ وحدة لكل تفاعل للمصححين؛ ٢-٤ وحدات لكل تفاعل للأشكال الخارجية)؛ قم بزيادة أو تقليل الكمية حسب حجم التفاعل. يمكن الاطلاع على تفاصيل بروتوكولات التحسين في صفحة المرجع الفني العام للبوليميراز. س: هل قطع الحمض النووي الناتجة عن بوليميراز الحمض النووي Deep Vent ذات نهايات غير لاصقة أم أنها تحتوي على قاعدة واحدة بارزة في الطرف ٣' كما هو الحال في بوليميراز الحمض النووي Taq؟ ج: يُنتج بوليميراز الحمض النووي Deep Vent أكثر من ٩٥٪ من القطع ذات النهايات غير اللاصقة. تُشبه مشتقات الإكسو إنزيم Taq DNA بوليميراز من حيث وجود نوعين رئيسيين من النهايات؛ 70% منها ذات نهايات غير لاصقة، بينما 30% منها عبارة عن نهايات بارزة أحادية القاعدة في الطرف 3'. س: هل يُمكنني استخدام إنزيم Deep Vent DNA بوليميراز لتلميع نهايات قطع الحمض النووي؟ ج: نعم، يُمكن استخدام إنزيمات DNA بوليميراز ذات نشاط التدقيق (إكسونوكلياز 3'→5') لملء النهايات البارزة في الطرف 5' وإزالة الامتداد في الطرف 3'. يُفضل استخدام إنزيم DNA بوليميراز I، الجزء الكبير (Klenow) (NEB# M0210) لأنه يعمل عند درجة حرارة 25 درجة مئوية، ويُمكن استخدامه في مجموعة متنوعة من المحاليل المنظمة، كما يُمكن تعطيله بالحرارة. س: أرغب في استنساخ منتجات امتداد البادئ المصنوعة باستخدام إنزيم Vent DNA بوليميراز أو إنزيم Deep Vent DNA بوليميراز. هل بعض البروتوكولات أفضل من غيرها؟ ج: تعتمد أفضل البروتوكولات على الاستنساخ ذي النهايات غير اللاصقة في ناقل مُعالج بالفوسفاتاز. يجب أن يكون الجزء المُدخل مُفعّلاً عند طرفه 5' ما لم يتم تصنيع البادئ مع مجموعة فوسفات عند الطرف 5'. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Vent® (NEB# M0254) أو بوليميراز الحمض النووي Deep Vent® (NEB# M0258) لإنشاء نهايات غير لاصقة على منتجات تمديد البادئ المصنوعة باستخدام بوليميراز الحمض النووي Taq (NEB# M0267)؟ ج: نعم. استخلص الحمض النووي باستخدام الفينول:الكلوروفورم، ثم قم بترسيبه باستخدام حجمين من الإيزوبروبانول. أعد تعليقه في محلول تفاعل ThermoPol بتركيز 1X، وأضف 1-2 وحدة من بوليميراز الحمض النووي Vent أو بوليميراز الحمض النووي Deep Vent لكل 100 ميكرولتر من التفاعل، و200 ميكرومول من النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs)؛ امزج جيدًا، ثم حضّن المزيج عند 72 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.