نيو إنجلاند بيولابس، M0259L، بوليميراز الحمض النووي ديب فينت® (خارجي)

الفئات ذات الصلة تطبيقات بوليميرازات تفاعل البوليميراز المتسلسل الأخرى تفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني، مواصفات تفاعل البوليميراز المتسلسل تعريف الوحدة تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي ستدمج 10 نانومول من dNTP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض لمدة 30 دقيقة عند 75 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل ThermoPol® بتركيز 1X، محلول تفاعل ThermoPol® بتركيز 1X، 20 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار (NH4)2SO4، 10 ملي مولار KCl، 2 ملي مولار MgSO4، 0.1% Triton® X-100 (الأس الهيدروجيني 8.8 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 0.1% Triton® X-100، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : لا. الوزن الجزيئي النظري: 89000 دالتون . إكسونوكلياز 5' - 3' : لا. إكسونوكلياز 3' - 5': لا. إزاحة السلسلة : +++. شروط فحص الوحدة: محلول تفاعل ThermoPol® بتركيز 1X، 200 ميكرومولار من كل dNTP بما في ذلك [3 [H]-dTTP، 15 نانومول من الحمض النووي M13 المُحفَّز. الأسئلة الشائعة : س: هل قطع الحمض النووي الناتجة عن بوليميراز الحمض النووي Deep Vent (exo-) ذات نهايات غير لاصقة أم أنها تحتوي على قاعدة واحدة بارزة في الطرف 3' كما هو الحال مع بوليميراز الحمض النووي Taq؟ ج: هناك نوعان رئيسيان من النهايات؛ 70% منها ذات نهايات غير لاصقة، بينما 30% منها ذات قاعدة واحدة بارزة في الطرف 3'. إذا كنت ترغب في الحصول على قطع ذات نهايات غير لاصقة بنسبة تزيد عن 95%، فاستخدم بوليميراز الحمض النووي المُصحِّح مثل بوليميراز الحمض النووي Deep Vent (NEB# M0258). س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Deep Vent (exo-) في محاليل منظمة أخرى؟ ج: لا يُنصح باستخدام محاليل منظمة أخرى. س: لا يعمل بوليميراز الحمض النووي Deep Vent (exo-) لديّ، بينما يعمل بوليميراز الحمض النووي Taq بشكل جيد. أ: إن بوليميرازات الحمض النووي التي تتميز بدقة عالية بفضل وجود وحدة إكسونيوكلياز مصححة، تتطلب دقة أكبر في استخدامها من مشتقاتها الخارجية أو بوليميرازات الحمض النووي التي لا تحتوي على وحدة إكسونيوكلياز مصححة، مثل بوليميراز الحمض النووي Taq. كما أن الاختلافات في قيمة ثابت ميكايليس (Km) للحمض النووي بين بوليميرازات الحمض النووي المختلفة قد تُغير درجة حرارة التلدين الفعالة للبادئ. نقترح مراجعة الإرشادات العامة المرفقة مع البوليميراز والالتزام بالتوصيات التالية: 1. استخدم المحلول المنظم المرفق مع البوليميراز. 2. استخدم النيوكليوتيدات القياسية الأربعة (dNTPs) (وليس dUTP أو dITP). 3. يبيع بعض موردي النيوكليوتيدات مخزونًا ملوثًا بـ dUTP، مما قد يُسبب مشاكل مع بوليميرازات الحمض النووي المقاومة للحرارة. لتجنب التلوث، نقترح استخدام نيوكليوتيدات NEB. 4. اضبط درجة حرارة التلدين للبادئ. 5. اضبط مستوى المغنيسيوم (2، 4، 6 أو 8 ملي مولار). ٦. اضبط كمية البوليميراز (١-٢ وحدة لكل ١٠٠ ميكرولتر من التفاعل للمصححين؛ ٢-٤ وحدات لكل ١٠٠ ميكرولتر من التفاعل للأشكال الخارجية)؛ قم بزيادة أو تقليل الكمية حسب حجم التفاعل. يمكن الاطلاع على تفاصيل بروتوكولات التحسين في تبويب البروتوكولات.