نيو إنجلاند بيولابس، M0263L، إكسونوكلياز T7

الفئات ذات الصلة: الإكسونوكليازات والإندونيوكليازات غير المحددة. تعريف الوحدة: تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لإنتاج 1 نانومول من ديوكسي ريبونوكليوتيد قابل للذوبان في الأحماض في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر في 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 1X NEBuffer 4 مع 0.15 ملي مول من الحمض النووي المزدوج [3H]-DNA المُعالج بالموجات فوق الصوتية. شروط التفاعل: محلول NEBuffer™ 4 بتركيز 1X، يُحضن عند درجة حرارة 25 درجة مئوية. محلول NEBuffer™ 4 بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 1 ملي مولار DTT (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 5 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 8 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : لا. الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين إنزيم T7 Exonuclease وإنزيم Lambda Exonuclease (NEB# M0262)؟ ج: يتميز إنزيم T7 Exonuclease بنشاط أقل على الحمض النووي أحادي السلسلة مقارنةً بإنزيم Lambda Exonuclease، ويعمل عند الشقوق على عكس إنزيم Lambda Exonuclease، كما أنه أقل قدرة على معالجة الحمض النووي. ونظرًا لكونه أقل قدرة على معالجة الحمض النووي، فقد يكون أكثر فائدة لعمليات الحذف المتداخلة أحادية الاتجاه. يمكن تخفيف الإنزيم للتحكم في سرعة التفاعل. مع إنزيم عالي الكفاءة، مثل إكسونوكلياز لامدا، ينتج عن التخفيف مزيج من نواتج مهضومة بالكامل وركيزة غير مهضومة. س: ما الفرق بين إكسونوكلياز T7 وإكسونوكلياز III (NEB# M0206)؟ ج: يعمل إكسونوكلياز III في الاتجاه من 3' إلى 5'، عكس اتجاه عمل إكسونوكلياز T7 وإكسونوكلياز لامدا. س: ما هو نشاط إكسونوكلياز T7 في محاليل NEBuffers؟ ج: محلول NEBuffer 1: 30%، محلول NEBuffer 2: 25%، محلول NEBuffer 3: 1%، محلول NEBuffer 4: 100%. س: هل يمكن تعطيل إكسونوكلياز T7 بالحرارة؟ ج: لا. س: ما هي أفضل طريقة لإنتاج نواتج جزئية باستخدام إكسونوكلياز T7؟ ج: يجب معايرة الإنزيم وفقًا للركيزة. يُقترح التخفيف التسلسلي للحمض النووي بعد حضانته لفترة زمنية محددة. ابدأ بحضانة لمدة 30 دقيقة. يمكن استخدام الحضانة في درجة حرارة الغرفة لإبطاء التفاعل. إذا كانت كمية الحمض النووي محدودة، يمكن تخفيف الإنزيم في محلول التفاعل لاستخدامه فورًا. س: هل يمكن جعل نهايات الحمض النووي غير لاصقة باستخدام إنزيم T7 إكسونوكلياز؟ ج: لا. استخدم بوليميراز الحمض النووي الأول، الجزء الكبير (كلينو) (NEB# M0210) لملء النهايات 5' المتدلية (وتسمى أيضًا النهايات 3' المتراجعة) وقم بإزالة النهايات 3' المتدلية، أو استخدم نوكلياز فول المونج (NEB# M0250) لإزالة النهايات 3' أو 5' المتدلية. ملاحظة: لا يمكن ملء النهايات 3' المتدلية. س: هل سيعمل إنزيم T7 إكسونوكلياز في محلول rCutSmart؟ ج: نعم، سيعمل إنزيم T7 إكسونوكلياز في محلول rCutSmart. للاطلاع على نسبة نشاطه الوظيفي في rCutSmart، ونسبة نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي الأخرى في عملية الاستنساخ، يُرجى الرجوع إلى مخطط نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي في محلول rCutSmart®. س: هل يمكن استخدام إكسونوكلياز I مع إكسونوكلياز ثنائي السلاسل لتنظيف مستحضرات البلازميد؟ ج: يمكن استخدام إكسونوكلياز I مع إكسونوكلياز لامدا (NEB# M0262) لتنظيف مستحضرات البلازميد. كما يمكن استخدام إكسونوكلياز III (NEB# M0206) وإكسونوكلياز T7 (NEB# M0263)، ولكنهما قد يُتلفان البلازميدات المقطوعة. على الرغم من إمكانية استخدام Exonuclease I، إلا أننا نوصي باستخدام Exonuclease V (RecBCD) (NEB #M0345) لإزالة الحمض النووي الصبغي بعد تحضير البلازميد (انظر ملاحظة التطبيق الخاصة بنا: استخدام Exonuclease V (RecBCD) للتخلص من الحمض النووي الجينومي المتبقي عند تنقية البلازميدات منخفضة النسخ باستخدام مجموعة Monarch® Plasmid Miniprep Kit).