نيو إنجلاند بيولابس، M0269L، بوليميراز الحمض النووي phi29

مثالي لتضخيم الإزاحة المتعددة. الفئات ذات الصلة: التضخيم متساوي الحرارة وتطبيقات إزاحة السلسلة. تضخيم الجينوم الكامل وتضخيم الإزاحة المتعددة. مواصفات التضخيم متساوي الحرارة. تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي ستدمج 0.5 بيكومول من dNTP في مادة غير قابلة للذوبان في الحمض في 10 دقائق عند 30 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي phi29 بتركيز 1X، مُضاف إليه ألبومين مُعاد التركيب، من الدرجة المستخدمة في البيولوجيا الجزيئية. يُحضن عند 30 درجة مئوية. محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي phi29 بتركيز 1X: 50 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار MgCl2، 10 ملي مولار (NH4)2SO4، 4 ملي مولار DTT (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين : 10 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، 0.5% Tween® 20، 0.5% IGEPAL® CA-630، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي النظري: 67000 دالتون . الإكسونوكلياز: لا يوجد 5' - 3'. إنزيم إكسونوكلياز: نعم، إزاحة السلسلة : ++++، شروط فحص الوحدة: محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي phi29 بتركيز 1X، 0.1 ملغم/مل من الألبومين المؤتلف، 0.01 ملغم/مل من الحمض النووي λ المهضوم بواسطة إنزيم HindIII، 0.2 ميكرومول من dTTP بما في ذلك [3H]-dTTP، 0.2 مليمول من dGTP، 0.2 مليمول من dATP، و0.2 مليمول من dCTP. الأسئلة الشائعة : س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي phi29 في محاليل NEBuffer أخرى؟ ج: نعم. يكون نشاط بوليميراز الحمض النووي phi29 بنسبة 30% في محلول NEBuffer 1، و35% في محلول NEBuffer 2، و25% في محلول NEBuffer 3، و90% في محلول NEBuffer 4، و30% في محلول ThermoPol. كما أنه نشط بنسبة 100% في محلول rCutSmart بإضافة 4 ملي مول من ثنائي ثيوثريتول (DTT) (التركيز النهائي). س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي phi29 لإزالة النهايات غير المتداخلة؟ ج: ينتج هذا الإنزيم شظايا ذات نهايات غير متداخلة أثناء تخليق الحمض النووي، لذا نظريًا يمكن استخدامه لإزالة هذه النهايات. تقليديًا، يُستخدم بوليميراز الحمض النووي I، الجزء الكبير (Klenow) (NEB# M0210) أو بوليميراز الحمض النووي T4 (NEB# M0203) لإزالة النهايات غير المتداخلة. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي phi29 لملء النهايات المتدلية 3'؟ ج: لا، لا تستطيع بوليميرازات الحمض النووي ملء النهايات المتدلية 3'. لإنشاء نهايات غير متداخلة، يجب إزالة هذه النهايات. يُعد بوليميراز الحمض النووي I، الجزء الكبير (Klenow) (NEB# M0210) أو بوليميراز الحمض النووي T4 (NEB# M0203) الخيار الأمثل لإزالة النهايات المتدلية 3'. يمكن استخدام نوكلياز الفاصوليا الخضراء (NEB# M0250) لإزالة النتوءات من الطرف 3'. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي phi29 لإزالة النتوءات من الطرف 5'؟ ج: لا، لا تستطيع بوليميرازات الحمض النووي إزالة النتوءات من الطرف 5'. استخدم نوكلياز الفاصوليا الخضراء (NEB# M0250) لإزالة النتوءات من الطرف 5'. س: هل يمكن تعطيل بوليميراز الحمض النووي phi29 بالحرارة؟ ج: نعم، سخّنه عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. س: ما هو معدل إضافة النيوكليوتيدات بواسطة بوليميراز الحمض النووي phi29 إلى قالب أحادي السلسلة مُهيأ؟ ج: فيما يلي معدلات بوليميراز الحمض النووي phi29 عند درجات حرارة مختلفة باستخدام قالب M13 أحادي السلسلة مُهيأ (1): 2280 نيوكليوتيد/دقيقة عند 30 درجة مئوية، 1490 نيوكليوتيد/دقيقة عند 15 درجة مئوية، 290 نيوكليوتيد/دقيقة عند 4 درجات مئوية. (1) Soengas, MS, Gutierrez, MS and Salas, M. 1995 J. Mol. Biol.253(4):517-529. س: هل يعمل بوليميراز الحمض النووي phi29 في محلول rCutSmart؟ ج: نعم، يعمل بوليميراز الحمض النووي phi29 في محلول rCutSmart. لمعرفة نسبة نشاطه الوظيفي في rCutSmart، ونسبة نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي الأخرى في عملية الاستنساخ، يُرجى الرجوع إلى مخطط نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي في محلول rCutSmart®. س: هل تُزوَّد بوليميرازات الحمض النووي NEB بـ dNTPs؟ ج: لا، يجب طلب النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs) بشكل منفصل. يمكن طلبها كمزيج مناسب (مزيج محلول ديوكسي نيوكليوتيد (dNTP) (NEB# N0447) بتركيز 10 ملي مولار لكل ديوكسي نيوكليوتيد) أو كمجموعة من 4 أنابيب فردية (مجموعة محلول ديوكسي نيوكليوتيد (dNTP) (NEB# N0446) بتركيز 100 ملي مولار لكل ديوكسي نيوكليوتيد).