نيو إنجلاند بيولابس، M0274L، بوليميراز الحمض النووي T7 (غير معدل)

يحفز إنزيم بوليميراز الحمض النووي T7 تضاعف الحمض النووي لفيروس T7 أثناء العدوى. يُغني معدل البلمرة العالي لهذا الإنزيم عن فترات الحضانة الطويلة. التصنيفات ذات الصلة: تطبيقات معالجة الحمض النووي، التضخيم متساوي الحرارة، مواصفات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي تُدمج 10 نانومولات من النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTP) في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض خلال 30 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي T7 بتركيز 1X، مدعم بالألبومين المؤتلف، من الدرجة المستخدمة في البيولوجيا الجزيئية. يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي T7 بتركيز 1X: 20 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار MgCl2، 1 ملي مولار DTT (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 50 ملي مولار KPO4، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري: 75 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. إكسونوكلياز 5' - 3': لا. إكسونوكلياز 3' - 5': نعم. إزاحة السلسلة : لا. شروط فحص الوحدة: 100 ملي مولار KCl، 20 ملي مولار Tris-HCl (الأس الهيدروجيني 7.6)، 6 ملي مولار MgCl2، 0.5 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA. ٥٠ ميكروغرام/مل من الألبومين المُعاد تركيبه، ١٥٠ ميكرومول من النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs) بما في ذلك [3H]-dTTP، و٧٠ ميكروغرام/مل من الحمض النووي لحيوانات الرنجة المنفصلة. معدل الخطأ ~ ١٥ × ١٠⁻⁶ قاعدة. الأسئلة الشائعة : س: ما هو بوليميراز الحمض النووي الذي يمكنني استخدامه لتعديل نهايات الحمض النووي؟ ج: ملاحظة: يجب إضافة النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs) إلى تفاعلات التعديل. نوصي بشكل أساسي باستخدام بوليميراز الحمض النووي الأول، الجزء الكبير (كلينو) (M0210) للتعديل. يكون النشاط الأمثل للتعديل عند درجة حرارة الغرفة (٢٥ درجة مئوية). يمكن أيضًا استخدام بوليميراز الحمض النووي T4 (M0203) للتعديل، ولكن يجب استخدامه عند ١٢ درجة مئوية لمنع تكوّن النهايات المتراجعة نظرًا لنشاطه القوي جدًا كإنزيم إكسونيوكلياز ٣'-٥'. لإزالة النهايات غير المتراصة عند درجات حرارة محبة للحرارة، نوصي باستخدام بوليميراز الحمض النووي Vent (M0254) أو Deep Vent (M0258). بينما يمكن استخدام بوليميراز Q5 عالي الدقة لإزالة النهايات غير المتراصة عند درجات حرارة محبة للحرارة، إلا أنه يتطلب ظروفًا صارمة جدًا للتخزين لضمان فعاليته المثلى، ويجب استخدامه فقط مع محلول التفاعل Q5. إن إنزيم Mung Bean Nuclease (M0250) هو الإنزيم الوحيد في كتالوجنا القادر على إزالة النهايات المتدلية 5'. لتعطيله، نوصي بالتسخين مع إضافة EDTA؛ يرجى الضغط هنا للاطلاع على إرشادات التعطيل. تُستخدم بوليميرازات الحمض النووي غالبًا لإزالة النهايات غير المتراصة عن طريق ملء النهايات 5' البارزة (نشاط بلمرة 5' → 3') و/أو تقليص النهايات 3' المتدلية (نشاط إكسونوكلياز 3' → 5'). في غياب النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs)، سيتغلب نشاط الإكسونوكلياز 3'-5' على نشاط البوليميراز 5'-3'، مما يؤدي إلى إزالة عدد أكبر من النيوكليوتيدات من المطلوب. مع ذلك، يُفضل الإنزيم نشاط البلمرة 5'-3' على نشاط الإكسونوكلياز 3'-5' في وجود النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات. يضمن وجود النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات إعادة ملء النيوكليوتيدات مقابل القالب، مما ينتج عنه نهايات غير لاصقة. لمزيد من المعلومات، يُرجى الاطلاع على الأسئلة الشائعة الأخرى: ما معنى نشاط الإكسونوكلياز بالنسبة لبوليميراز الحمض النووي؟ ما هي النهايات التي ستكون عليها نواتج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)؟ س: هل يُمكنني استخدام بوليميراز الحمض النووي لملء النهايات البارزة 3' أو إزالة النهايات البارزة 5'؟ ج: لا، لا يُمكن لبوليميراز الحمض النووي ملء النهايات البارزة 3' لأنه يُضيف النيوكليوتيدات فقط في اتجاه 5'-3'. لإزالة النهايات البارزة 3'، يُرجى الاطلاع على الأسئلة الشائعة حول إزالة النهايات غير اللاصقة. لا، لا يُمكن لبوليميراز الحمض النووي إزالة النهايات البارزة 5'. إنزيم نوكلياز الفاصوليا الخضراء (M0250) هو الإنزيم الوحيد في الكتالوج القادر على إزالة النهايات المتدلية 5'. س: كيف يمكنني تعطيل بوليميراز الحمض النووي هذا بالحرارة؟ ج: بالنسبة لبوليميراز الحمض النووي الأول (M0209)، وجزء كلينو الكبير (M0210)، وبوليميراز الحمض النووي T4 (M0203)، وبوليميراز الحمض النووي T7 (M0274): لمنع تكوّن نهايات متراجعة (بعد نقطة التضاؤل ​​المطلوبة)، سخّن حمامًا مائيًا أو جهاز تدوير حراري إلى 75 درجة مئوية. قبل وضع العينة عند 75 درجة مئوية، أضف EDTA إلى عينتك بتركيز نهائي 10 ملي مولار (لربط العامل المساعد Mg2+)، ثم حضّنها عند 75 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. لاحظ أن ارتفاع درجات الحرارة، أو استخدام كميات زائدة من الإنزيم، أو عدم إضافة النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs)، أو طول مدة التفاعل، ستؤدي إلى ظهور نهايات متراجعة نتيجة لنشاط الإكسونوكلياز 3' → 5' للإنزيم. يُعطَّل جزء كلينو (3'→5' exo-) بالتسخين عند 75 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. لا حاجة إلى EDTA لعدم وجود نشاط إكسونوكلياز 3'-5'. سؤال: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي هذا في تفاعلات الوسم والتعبئة الجزئية؟ جواب: للحصول على تغطية كاملة الطول وموسومة بشكل متساوٍ، يُفضَّل استخدام بوليميراز الحمض النووي I (الإشريكية القولونية) (M0209). يمكن أيضًا استخدام بوليميراز الحمض النووي Taq عند درجات حرارة تفاعل مرتفعة. للحصول على إنتاجية عالية من الحمض النووي المزدوج القصير والمجزأ (~250 زوجًا قاعديًا)، يُوصى باستخدام جزء كلينو (3'→5' exo-) (M0212). ترجمة الشق: عند استخدام ترجمة الشق لتوليد المجسات، يُستخدم عادةً إنزيم DNase I لعمل شق في الحمض النووي. يقوم بوليميراز الحمض النووي I (من الإشريكية القولونية) بإزالة القواعد الرائدة عند الشق بنشاطه الإكسونوكليازي 5'→3'، ثم يملأ الفراغ بقواعد موسومة. النيوكليوتيدات المعدلة: نظرًا لأن كفاءة دمج النيوكليوتيدات المعدلة أقل عمومًا من نظيراتها الطبيعية، فإن الاستبدال الكامل قد يتسبب في توقف البوليميراز. لتحقيق التوازن بين الإنتاجية وكفاءة الوسم، نوصي عمومًا باختبار نسب مختلفة من النيوكليوتيدات المعدلة إلى النيوكليوتيدات الطبيعية. لا يُنصح باستخدام البوليميرازات التالية في تفاعلات الوسم أو الملء الجزئي لأن نشاطها الإكسونوكليازي 3'-5' يصعب التحكم فيه: بوليميراز الحمض النووي I، الجزء الكبير (كلينو) (M2010)، بوليميراز الحمض النووي T4 (M0203)، بوليميراز الحمض النووي T7 (M0274). س: ما هي الأسباب الرئيسية لفشل تفاعل التثبيط؟ ج: قد تؤدي الظروف التالية إلى طغيان نشاط الإكسونوكلياز على نشاط البوليميراز، مما ينتج عنه نهايات متراجعة بدلاً من نهايات غير متداخلة: عدم إضافة النيوكليوتيدات، أو انخفاض تركيز النيوكليوتيدات، إضافة كمية كبيرة من الإنزيم، فترة حضانة طويلة جدًا، حضانة في درجات حرارة أعلى من درجة الحرارة الموصى بها، تعطيل الإنزيم بالحرارة بدون EDTA. الأسئلة الشائعة: هل يمكن تعطيل هذا البوليميراز بالحرارة؟ يرجى الاطلاع على بروتوكول إزالة النهايات غير المتداخلة الموصى به لبوليميراز الحمض النووي الأول، الجزء الكبير (كلينو) بالنقر هنا. بوليميراز الحمض النووي T4 بالنقر هنا. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي هذا في محاليل NEBuffers الأخرى لملء أو إزالة النهايات غير المتداخلة؟ ج: لملء النهايات غير المتداخلة 5'، يكون بوليميراز الحمض النووي الأول (الإشريكية القولونية)، وجزء كلينو الكبير، وجزء كلينو (إكسونوكلياز 3'-5')، وبوليميراز الحمض النووي T4 نشطًا في جميع محاليل NEBuffers، ولكن محلول NEBuffer 2/2.1/r2.1 يوفر النشاط الأمثل. يُلاحظ النشاط الأمثل لإنزيم بوليميراز الحمض النووي T7 في محلوله الخاص، بينما ينخفض ​​نشاطه بنسبة 50% في محاليل NEBuffer الأخرى. للمقارنة بين تركيبات محاليل NEBuffer، انقر هنا. للاطلاع على نشاط المزيد من إنزيمات تعديل الحمض النووي في محلول rCutSmart Buffer، انقر هنا. لتقليل تشابك الأطراف، استخدم محاليل NEBuffers، وبوليميراز الحمض النووي الأول (E. coli)، وبوليميراز الحمض النووي الأول، الجزء الكبير (Klenow)، وبوليميراز الحمض النووي T4، وبوليميراز الحمض النووي T7. 1 YNY 50% 1.1 YNY 50% r1.1 YNY 50% 2 مثالي Y 50% 2.1 YYY 50% r2.1 YY مثالي 50% 3 YYN 50% 3.1 YYN 50% r3.1 YYN 50% 4 YYY 50% CutSmart YYY 50% rCutSmart YYY 50% محلول ربط الحمض النووي T4 YY محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي T7 مثالي. يشير الحرف "Y" إلى إمكانية استخدام هذا البوليميراز في المحلول المحدد. يشير الحرف "N" إلى عدم إمكانية استخدام هذا البوليميراز في المحلول المحدد. المحاليل المثلى موضحة. لا يمكن استخدام إنزيم كلينو (3'-5' exo-) لإزالة الأجزاء المتدلية. س: هل توفر شركة NEB بوليميراز T7 المعدل؟ ج: لا، لا تملك شركة NEB ترخيصًا لبيع بوليميراز الحمض النووي T7 المعدل، ويتم بيع الاسم التجاري Sequenase™ من قبل شركة GE Healthcare.