نيو إنجلاند بيولابس، M0275L، بوليميراز الحمض النووي Bst، جزء كبير

هذا المنتج متوفر بصيغة خالية من الجلسرين. الفئات ذات الصلة: التضخيم متساوي الحرارة وإزاحة السلسلة. التطبيقات: تضخيم الجينوم الكامل، التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة، مواصفات التضخيم متساوي الحرارة. تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي تُدمج 10 نانومول من dNTP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض خلال 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل ThermoPol® بتركيز 1X، يُحضن عند 65 درجة مئوية. محلول تفاعل ThermoPol® بتركيز 1X، 20 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار (NH4)2SO4، 10 ملي مولار KCl، 2 ملي مولار MgSO4، 0.1% Triton® X-100 (الأس الهيدروجيني 8.8 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محلول التخزين NEBuffers : 10 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، 0.1% Triton® X-100، الأس الهيدروجيني 7.1 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. الوزن الجزيئي النظري: 67000 دالتون. إكسونوكلياز 5' - 3': لا . إكسونوكلياز 3' - 5': لا. إزاحة السلسلة : ++++. شروط فحص الوحدة: 50 mM KCl، 20 mM Tris-HCl (الأس الهيدروجيني 8.8)، 10 mM MgCl2، 30 نانومول من M13mp18 SS DNA، 70 نانومول من بادئ تسلسل M13 (–47) 24 قاعدة، 200 ميكرومول من dATP، 200 ميكرومول من dCTP، 200 ميكرومول من dGTP، 100 ميكرومول من dTTP بما في ذلك [3H]-dTTP، و100 ميكروغرام/مل من BSA. الأسئلة الشائعة : س: هل يتم تزويد بوليميرازات الحمض النووي NEB بالنيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs)؟ ج: لا، يجب طلب النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات بشكل منفصل. يمكن طلبها كمزيج جاهز (مزيج محلول ديوكسي نيوكليوتيد (dNTP) (NEB# N0447) بتركيز 10 ملي مولار لكل ديوكسي نيوكليوتيد) أو كمجموعة من 4 أنابيب منفصلة (مجموعة محلول ديوكسي نيوكليوتيد (dNTP) (NEB# N0446) بتركيز 100 ملي مولار لكل ديوكسي نيوكليوتيد). س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst في محاليل NEBuffers الأخرى، بما في ذلك rCutSmart؟ ج: يُلاحظ النشاط الأمثل في محلول تفاعل ThermoPol (نشاط 200%). يتم اختبار الوحدة في محلول غير مثالي مأخوذ من المراجع العلمية. يُظهر الإنزيم نشاطًا بنسبة 50% في محاليل NEBuffers 1 و3، ونشاطًا بنسبة 100% في محاليل 2 و4. يجب إضافة 0.1% من Triton X-100 أو 100 ميكروغرام/مل من الألبومين المُعاد تركيبه إلى محاليل NEBuffers 1-4 لتحقيق هذه القيم. يمكن استخدامه أيضًا في محلول rCutsmart. للاطلاع على نسبة نشاطه الوظيفي في rCutsmart، ونسبة نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي الأخرى في عملية الاستنساخ، يُرجى الرجوع إلى مخطط نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي في محلول rCutSmart®. سؤال: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst لإزالة النهايات غير المتداخلة؟ جواب: يمكن ملء النهايات 5' المتدلية (النهايات 3' المتراجعة)، ولكن لن تتم إزالة النهايات 3' المتدلية لأن الإنزيم يفتقر إلى نشاط الإكسونوكلياز. إنزيم بوليميراز الحمض النووي الأول، الجزء الكبير (كلينو) (NEB# M0210) هو الإنزيم الأمثل لهذا التطبيق. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst لملء النهايات المتدلية 3'؟ ج: لا، لا تستطيع بوليميرازات الحمض النووي ملء النهايات المتدلية 3'. لإنشاء نهايات غير لاصقة، يجب إزالة النهايات المتدلية 3'. يُعد بوليميراز الحمض النووي الأول، الجزء الكبير (كلينو) (NEB# M0210)، أو بوليميراز الحمض النووي T4 (NEB# M0203)، أو نوكلياز فول المونج (NEB# M0250) أفضل الخيارات لإزالة النهايات المتدلية 3'. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst لإزالة النهايات المتدلية 5'؟ ج: لا، لا تستطيع بوليميرازات الحمض النووي إزالة النهايات المتدلية 5'. استخدم نوكلياز فول المونج (NEB# M0250) لإزالة النهايات المتدلية 5'. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst لتسلسل الدورة الحرارية؟ ج: لا، درجات حرارة التفاعل مرتفعة جدًا لاستقرار الإنزيم. س: هل يمكن لإنزيم بوليميراز الحمض النووي Bst أن يبدأ من شق في الحمض النووي؟ ج: نعم، يمكنه بدء تخليق السلسلة من الشق باستخدام مجموعة OH في الطرف 3' كبادئ. س: هل يمكن استخدام إنزيم بوليميراز الحمض النووي Bst في تفاعلات الوسم وتفاعلات التعبئة الجزئية؟ ج: نعم، يُوصى أيضًا باستخدام جزء كلينو (3'→5' exo-) (NEB# M0212) لهذه التطبيقات. س: هل يمكن تخفيف إنزيم بوليميراز الحمض النووي Bst؟ ج: نعم، يمكن تخفيفه وتخزينه في محلول منظم يحتوي على 0.1% من Triton X-100 أو 100 ميكروغرام/مل من BSA. المحلول المنظم المفضل هو 50 ملي مولار من كلوريد البوتاسيوم، و10 ملي مولار من Tris-HCl (الأس الهيدروجيني 7.5)، و0.1 ملي مولار من EDTA، و1 ملي مولار من DTT، و0.1% من Triton X-100، و50% من الجلسرين. يمكن استخدام المخفف A (NEB# B8001S) أيضًا. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst في درجات حرارة أخرى غير 65 درجة مئوية؟ ج: نعم، يتمتع الإنزيم بالفعالية التالية: 10-15% عند 37 درجة مئوية، 30-45% عند 50 درجة مئوية، 100% عند 60-65 درجة مئوية، 20% عند 70 درجة مئوية. لا يُنصح باستخدامه في درجات حرارة أعلى من 70 درجة مئوية لأنه يُصبح غير فعال بالحرارة. س: هل يحتوي بوليميراز الحمض النووي Bst على إكسونوكلياز نشط للتدقيق من 3' إلى 5'؟ ج: لا. س: هل يُدمج بوليميراز الحمض النووي Bst، الجزء الكبير، dUTP؟ ج: نعم، ولكن مع تثبيط كبير عندما يحل dUTP محل أكثر من 50% من dTTP في التفاعل. بالنسبة للتفاعلات التي تستخدم dUTP، نوصي بمزيج بنسبة أقل من 50:50 من dUTP وdTTP أو استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® (M0537). س: هل يتمتع بوليميراز الحمض النووي Bst بنشاط النسخ العكسي؟ ج: نعم، ولكنه عادةً ما يكون منخفضًا جدًا للاستخدام في تطبيقات النسخ العكسي. يمكن استخدام مجموعات معينة من البادئات والأهداف مع Bst كإنزيم نسخ عكسي/بوليميراز الحمض النووي أحادي الإنزيم، ولكننا نوصي باستخدام بوليميراز نسخ عكسي مخصص. إذا كنت ترغب في استخدام بوليميراز واحد، فإن Bst 2.0® يتمتع بنشاط نسخ عكسي أعلى بكثير، ويجب استخدامه بدلاً من بوليميراز الحمض النووي Bst LF. س: هل لدى NEB مزيج رئيسي لتفاعلات LAMP أو RT-LAMP؟ ج: نعم. نحن نقدم العديد من الخيارات لدعم بروتوكولات LAMP/RT-LAMP. تتضمن مجموعة WarmStart® LAMP (DNA وRNA) (NEB #E1700) صبغة فلورية LAMP بتركيز 50X لدعم الكشف الفلوري عن تفاعلات LAMP/RT-LAMP. يحتوي مزيج WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNA & RNA) (NEB #M1800) على مؤشر لوني يعتمد على الرقم الهيدروجيني للكشف البصري عن تفاعلات LAMP/RT-LAMP (يشير تغير اللون من الوردي إلى الأصفر إلى التضخيم). تتضمن الإصدارات المُحدثة من كلا المنتجين إنزيم UDG وdUTP غير المستقرين حراريًا لتقليل خطر التلوث المتبقي (NEB #E1708 وNEB #M1804 على التوالي). بالإضافة إلى ذلك، يتوافق مزيج WarmStart Multi-Purpose LAMP/RT-LAMP 2X Master Mix (مع UDG) (NEB #M1708) مع أنواع مختلفة من عينات الإدخال ويدعم طرق كشف متعددة، بما في ذلك هيدروكسي نافثول الأزرق. تحتوي جميع مزيجات LAMP الرئيسية على مزيج من إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx وإنزيم بوليميراز الحمض النووي WarmStart Bst 2.0 لتضخيم سريع وفعال من كل من أهداف الحمض النووي DNA والحمض النووي الريبي RNA. لا يتطلب كل مزيج سوى بادئات LAMP التي يوفرها المستخدم وعينات الحمض النووي المستهدف (DNA أو RNA). س: ما هي تقنية LAMP وRT-LAMP؟ ج: التضخيم المتساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) هي طريقة تضخيم متساوية الحرارة مصممة للكشف عن الحمض النووي المستهدف دون الحاجة إلى معدات معقدة. تستخدم هذه التقنية بوليميراز DNA مُزيح للسلسلة، مثل بوليميراز Bst DNA، و4-6 بادئات تتعرف على 6-8 مناطق مميزة من الحمض النووي المستهدف لإجراء تفاعل تضخيم عالي التخصص. توفر تقنية LAMP حساسية عالية (تصل إلى فيمتوغرام أو أقل من 10 نسخ من الهدف) مع نتائج سريعة: يمكن إجراء التفاعلات في غضون 5-10 دقائق فقط. يمكن إجراء التفاعلات بموارد محدودة، باستخدام حمام مائي للحضانة والكشف عن النتائج بالعين المجردة، أو باستخدام القياس في الوقت الحقيقي وأجهزة عالية الإنتاجية. يتم الكشف عن أهداف RNA بإضافة بسيطة لإنزيم النسخ العكسي إلى تفاعل LAMP، بينما يتم إجراء RT-LAMP كعملية متساوية الحرارة من خطوة واحدة. إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx (NEB #M0380) هو بوليميراز DNA موجه بواسطة RNA، مقترن بأبتامر قابل للارتباط العكسي، مما يثبط نشاط RTx عند درجة حرارة أقل من 40 درجة مئوية، وهو ما يجعله مناسبًا بشكل خاص لتقنية RT-LAMP. لمعرفة المزيد والاطلاع على منتجاتنا الخاصة بتقنية LAMP، يرجى زيارة صفحة نظرة عامة على تطبيقات LAMP. س: ما الفرق بين بوليميراز Bst DNA، الجزء الكبير، وBst 2.0، وBst 3.0، وبوليميراز Bst-XT DNA؟ ج: جميع البوليميرازات الأربعة هي بوليميرازات DNA متوسطة الثبات الحراري، تتميز بنشاط إزاحة السلسلة، مما يُمكّنها من إجراء تفاعلات التضخيم متساوي الحرارة مثل LAMP. يُعد بوليميراز Bst 2.0 DNA نظيرًا مُصممًا حاسوبيًا لبوليميراز Bst DNA، الجزء الكبير. وقد صُمم لتحسين خصائصه في تفاعلات LAMP، بما في ذلك تحمل الملوحة، والثبات الحراري، ودمج dUTP. يتميز إنزيم Bst 2.0 بدقة عالية. ويُقدم إنزيم Bst 3.0 بعض التحسينات على Bst 2.0، أبرزها سرعة تضخيم أعلى. كما يتميز Bst 3.0 بأداء مُحسّن في تفاعلات LAMP عند درجات حرارة أعلى (تصل إلى 72 درجة مئوية)، إلا أنه لا يحتفظ بدقة Bst 2.0 العالية لبعض الأهداف. أما إنزيم Bst-XT فيجمع بين أفضل خصائص Bst 2.0 وBst 3.0، حيث يوفر دقة Bst 2.0 العالية وسرعة تضخيم Bst 3.0 العالية. كما يتميز Bst-XT بنشاطه ضمن نطاق أوسع من درجات الحرارة، مما يُتيح إجراء تفاعلات LAMP بين 50 و70 درجة مئوية. Bst-XT WarmStart NEB #M9204 Bst 2.0 WarmStart NEB #M0538 Bst 3.0 NEB #M0374 سرعة التضخيم ★★★★★ ★★★ ★★★★★ الخصوصية ★★★★★ ★★★★★ ★★ إعداد درجة حرارة الغرفة؟ مُفعّل مُفعّل غير مُوصى به درجة حرارة تفاعل LAMP المثلى 50-70 درجة مئوية 60-70 درجة مئوية 55-72 درجة مئوية متوفر خالي من الجلسرين نعم NEB #M9205 نعم NEB #M0402 نعم NEB #M0443 ★★★★★ = المنتج الأمثل والموصى به للتطبيق المحدد ★★ أو ★★★ = سيؤدي الغرض في التطبيق المحدد ★ = قد يؤدي الغرض ولكن لا يُوصى به س: ما هي الأسباب الرئيسية لفشل التفاعل باستخدام بوليميراز الحمض النووي Bst؟ ج: يمكن أن تؤدي درجات الحرارة التي تزيد عن 70 درجة مئوية إلى تقليل نشاط الإنزيم بشكل كبير، أو عدم استخدام المحلول المنظم المناسب الذي يحتوي إما على 0.1% من Triton X-100 أو 100 ميكروغرام/مل من BSA. انظر السؤال 1 أعلاه. س: متى يجب أن يكون بوليميراز الحمض النووي Bst هو الإنزيم المفضل؟ ج: بوليميراز الحمض النووي Bst جيد في إزاحة السلسلة. يُسدّ هذا الإنزيم فجوةً بين بوليميرازات الحمض النووي المحبة للحرارة وبوليميرازات الحمض النووي المحبة للحرارة المعتدلة. تبلغ درجة الحرارة المثلى له 60-65 درجة مئوية، وهي أعلى من درجة حرارة بوليميراز الحمض النووي الأول، الجزء الكبير (كلينو) (NEB #M0210)، وأقل من درجة حرارة بوليميراز الحمض النووي Vent® (NEB #M0254)، وهما بوليميرازان آخران يعملان على إزاحة السلسلة. يتيح هذا للباحثين نطاقًا أوسع من ظروف التفاعل لتحسين إزاحة السلسلة وربط البادئات. يُعدّ هذا مفيدًا في تصميم استراتيجيات التسلسل وتقنيات التضخيم متساوي الحرارة. كما تُسهّل درجة حرارة التفاعل المرتفعة عملية التسلسل عبر المناطق الغنية بالـ GC. مجموعة منتجات NEB المختارة القائمة على بوليميراز الحمض النووي Bst لتضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة 5′ إلى 3′ نشاط EXO سرعة التضخيم إعداد درجة حرارة الغرفة نشاط النسخ العكسي تحمل المثبط التطبيقات بوليميراز الحمض النووي Bst، كامل الطول ** غير متوفر/غير متوفر/غير متوفر/غير متوفر * تفاعلات ترجمة النيك في درجات حرارة مرتفعة بوليميراز الحمض النووي Bst، جزء كبير غير متوفر * غير متوفر * * تفاعلات إزاحة السلسلة العامة، البوليميراز الأصلي لـ LAMP وتضخيمات التشخيص الأخرى بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 غير متوفر ** غير متوفر ** ** تفاعلات تضخيم LAMP وSDA وغيرها محسنة بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 WarmStart غير متوفر ** *** ** ** فحوصات تضخيم متسقة، في درجة حرارة الغرفة، وعالية الإنتاجية بوليميراز الحمض النووي Bst 3.0 غير متوفر *** *** *** الأسرع والأكثر قوة تفاعلات LAMP وRT-LAMP. نشاط عالٍ للإنزيم الناسخ العكسي حتى 72 درجة مئوية *** المنتج الأمثل والموصى به لتطبيق محدد ** يعمل بشكل جيد لتطبيق محدد * سيؤدي الغرض في التطبيق المحدد، ولكنه غير موصى به غير متوفر غير قابل للتطبيق على هذا التطبيق