نيو إنجلاند بيولابس، M0276S، بوليميراز عديد الأدينين من الإشريكية القولونية

يحفز إنزيم بوليميراز بولي (أ) إضافة AMP من ATP إلى الطرف 3' من الحمض النووي الريبي (RNA) بشكل مستقل عن القالب. الفئات ذات الصلة : تعديل الحمض النووي الريبي، وتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) والنسخ العكسي، وتخليق الحمض النووي الريبي، والنسخ في المختبر (IVT)، والتطبيقات: تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). المواصفات: المواد المطلوبة ولكن غير المرفقة: ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500)، مثبط RNase، فأري (NEB #M0314) (اختياري). تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي ستدمج 1 نانومول من AMP في الحمض النووي الريبي (RNA) في حجم 20 ميكرولتر في 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل بوليميراز بولي (أ) بتركيز 1X، مضاف إليه 1 ملي مول من الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، يُحضن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. محلول تفاعل بوليميراز بولي (أ) بتركيز 1X: 50 ملي مول من Tris-HCl، 250 ملي مول من كلوريد الصوديوم (NaCl)، 10 ملي مول من كلوريد المغنيسيوم (MgCl2) (الأس الهيدروجيني 8.1 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 20 ملي مول من Tris-HCl، 300 ملي مول من كلوريد الصوديوم (NaCl)، 1 ملي مول من ثنائي ثيوثريتول (DTT)، 1 ملي مول من إيديتات ثنائي الصوديوم (EDTA)، 50% جلسرين، 0.1% (وزن/حجم) Triton® X-100، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. شروط فحص الوحدة: محلول تفاعل بوليميراز بولي (أ) بتركيز 1X، 1 ملي مول من الأدينوسين ثلاثي الفوسفات المؤتلف (rATP)، و500 نانوغرام من الحمض النووي الريبي (RNA) متعدد الأدينين (20-mer) الموسوم بـ 5' FAM في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر. بعد التحضين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، يُحدد طول إضافة عديد الأدينين إما عن طريق الفصل الكهربائي الهلامي أو باستخدام جهاز تسلسل الحمض النووي الشعيري الآلي. في هذا الاختبار، تُضيف 5 وحدات من الإنزيم ما يقارب 60 إلى 80 أدينوسين إلى بادئ الحمض النووي الريبي. في هذه الظروف، ستؤدي 20 وحدة من الإنزيم إلى استنفاد rATP. الأسئلة الشائعة : س: كيف يمكن تعطيل بوليميراز عديد الأدينين في الإشريكية القولونية دون تسخين التفاعل؟ ج: يمكن تعطيل بوليميراز عديد الأدينين بإضافة EDTA بتركيز نهائي قدره 10 ملي مولار إلى محلول التفاعل. س: هل يعمل بوليميراز عديد الأدينين في الإشريكية القولونية في محلول النسخ العكسي M-MuLV؟ ج: نعم. يعمل بوليميراز عديد الأدينين بكفاءة في محلول النسخ العكسي M-MuLV. إذا كان الهدف هو إجراء خطوة إضافة ذيل عديد الأدينين ثم تفاعل النسخ العكسي، فنوصي بإجراء هذين التفاعلين على مرحلتين متتاليتين. يمكن إجراء تفاعل إضافة ذيل عديد الأدينين أولاً باستخدام محلول النسخ العكسي، ثم إضافة المكونات الإضافية لتفاعل النسخ العكسي. س: هل يمكن استخدام بوليميراز عديد الأدينين من الإشريكية القولونية لإضافة ذيل عديد الأدينين إلى الحمض النووي أحادي السلسلة؟ ج: لا. لا يضيف بوليميراز عديد الأدينين من الإشريكية القولونية قواعد أدينين إلى الحمض النووي أحادي السلسلة. مع ذلك، فإن إنزيم النقل الطرفي (M0315) هو بوليميراز حمض نووي يضيف ذيل عديد الأدينين إلى الطرف 3' من الحمض النووي أحادي السلسلة باستخدام ديوكسي أدينين ثلاثي الفوسفات. يُرجى ملاحظة أن إنزيم النقل الطرفي لا يستخدم الأدينين ثلاثي الفوسفات. س: هل يمكن لبوليميراز عديد الأدينين من الإشريكية القولونية إضافة غوانوزين ثلاثي الفوسفات، ويوريدين ثلاثي الفوسفات، وسيتوزين ثلاثي الفوسفات إلى الحمض النووي الريبي؟ ج: يتميز بوليميراز عديد الأدينين بانتقائية عالية لإضافة الأدينين ثلاثي الفوسفات إلى الطرف 3' من الحمض النووي الريبي. مع ذلك، يُضيف إنزيم بوليميراز بولي (U) (M0337) جميع النيوكليوتيدات الريبوزية الأربعة إلى الحمض النووي الريبوزي (RNA). يكون الإنزيم أكثر نشاطًا مع اليوريدين ثلاثي الفوسفات (UTP)، ولكنه يُضيف أيضًا نيوكليوتيدات أخرى بمعدلات أبطأ. مع ذلك، يُرجى ملاحظة أن إنزيم بوليميراز بولي (U) قد يُظهر بعض التحيز في النشاط بناءً على تسلسل الطرف 3' للحمض النووي الريبوزي. في بعض هذه الحالات، لن يُضيف الإنزيم النيوكليوتيدات البديلة بكفاءة. س: هل يُمكنني وسم جزيء الحمض النووي الريبوزي متعدد الأدينين بقاعدة مُعدلة بـ Cy3/5 أو البيوتين باستخدام إنزيم بوليميراز بولي (A) من الإشريكية القولونية؟ ج: نعم. يُمكن دمج البيوتين-ATP بكفاءة بواسطة إنزيم بوليميراز بولي (A). كما يُمكن دمج القواعد المُعدلة بـ Cy3/5، ولكن بكفاءة أقل. يُمكن التحكم في طول الذيل وكثافة البيوتين من خلال تحسين وقت التفاعل، ونسبة ATP/بيوتين-ATP، وتركيز ATP الكلي. س: هل يعمل إنزيم بوليميراز بولي (A) من الإشريكية القولونية على الحمض النووي الريبوزي الناقل (tRNA)؟ ج: نعم. يعمل إنزيم بوليميراز عديد الأدينين (Poly(A)) في بكتيريا الإشريكية القولونية على الحمض النووي الريبوزي الناقل (tRNA) طالما أن له نهاية 3' حرة. س: هل كلوريد المنغنيز (MnCl2) ضروري للتفاعل مع إنزيم بوليميراز عديد الأدينين (Poly(A)) في بكتيريا الإشريكية القولونية؟ ج: يتطلب الإنزيم وجود كاتيون ثنائي التكافؤ لكي يعمل. في حال عدم وجود كلوريد المغنيسيوم (MgCl2)، يمكن إضافة كلوريد المنغنيز (MnCl2) بتركيز لا يزيد عن 1 ملي مولار. س: هل من الممكن إضافة نفس طول عديد الأدينين (poly A) إلى جميع جزيئات الحمض النووي الريبوزي (RNA) بواسطة إنزيم بوليميراز عديد الأدينين (Poly(A)) في بكتيريا الإشريكية القولونية؟ ج: لا. يتوزع عدد قواعد الأدينين (A) المضافة إلى مجموعة من جزيئات الحمض النووي الريبوزي (RNA) توزيعًا طبيعيًا (غاوسيًا)، لذا لا يمكن التخطيط لإضافة كمية محددة من قواعد الأدينين (A) إلى جميع جزيئات الحمض النووي الريبوزي (RNA) الموجودة في التفاعل. س: هل يمكننا استخدام مزيج النيوكليوتيدات الريبوزية (N0466) كبديل لإضافة محلول rATP لإضافة ذيل عديد الأدينين (poly A) إلى قالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) بواسطة إنزيم بوليميراز عديد الأدينين (Poly(A)) في بكتيريا الإشريكية القولونية؟ ج: لا يُنصح باستخدام مزيج rNTP في تفاعل بوليميراز بولي (أ) في بكتيريا الإشريكية القولونية، لأن النيوكليوتيدات الأخرى غير ATP لن يتم دمجها بواسطة بوليميراز بولي (أ)، وقد تُثبّط التفاعل. نبيع rATP كمنتج منفصل (P0756S). س: هل يستطيع بوليميراز بولي (أ) في بكتيريا الإشريكية القولونية إطالة قليل النيوكليوتيدات الريبية القصيرة والمثبتة على السطح؟ ما هو الحد الأدنى لطول تسلسل الحمض النووي الريبي الذي يمكن للإنزيم التعرف عليه، وبالتالي إطالته؟ ج: يستطيع بوليميراز بولي (أ) في بكتيريا الإشريكية القولونية إضافة بولي (أ) إلى قليل نيوكليوتيدات ريبية بطول 20 قاعدة. لم نُجرِ تجربة إضافة بولي (أ) إلى قليل نيوكليوتيدات ريبية مرتبط. س: ما هو الوزن الجزيئي لبوليميراز بولي (أ) في بكتيريا الإشريكية القولونية؟ ج: الوزن الجزيئي لبوليميراز بولي (أ) في بكتيريا الإشريكية القولونية هو 54.6 كيلو دالتون.