نيو إنجلاند بيولابس، M0289L، فوسفاتاز القطب الجنوبي

إنزيم الفوسفاتاز القطبي الجنوبي (AnP) هو فوسفاتاز قلوي حساس للحرارة، يُستخلص من مصدر مُعاد التركيب. التصنيفات ذات الصلة: الفوسفاتازات، تطبيقات تعديل الحمض النووي الريبي (RNA)، إزالة الفسفرة، استنساخ الحمض النووي الريبي (RNA). المواصفات: تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة بأنها كمية الإنزيم التي تُزيل الفسفرة من 1 ميكروغرام من الحمض النووي لناقل pUC19 المقطوع بإنزيم تقييد، مُنتجًا نهايات 5' متراجعة خلال 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تُعرَّف إزالة الفسفرة بأنها تثبيط إعادة التدوير بنسبة تزيد عن 95% في تفاعل الربط الذاتي، ويتم قياسها عن طريق التحويل إلى بكتيريا الإشريكية القولونية (E. coli). شروط التفاعل: محلول تفاعل فوسفاتاز القطب الجنوبي 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول تفاعل فوسفاتاز القطب الجنوبي 1X: 50 ملي مولار بيس-تريس-بروبان-هيدروكلوريد، 1 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 0.1 ملي مولار كلوريد الزنك (الأس الهيدروجيني 6 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 1 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 50% جلسرين، 0.01 ملي مولار كلوريد الزنك، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 80 درجة مئوية لمدة دقيقتين. الأوزان الجزيئية : الظاهرية: 35 كيلو دالتون، النظرية: 69 كيلو دالتون . شروط فحص الوحدة : يُزال الفوسفات من الحمض النووي الناقل في محلول منظم لإنزيم القطع الداخلي مُضاف إليه محلول تفاعل فوسفاتاز القطب الجنوبي. يُجرى الربط باستخدام 50 نانوغرام من الناقل باستخدام مجموعة الربط السريع من NEB (NEB #M2200). الأسئلة الشائعة : س: أي من الفوسفاتاز القلوي، Quick CIP، أو rSAP، أو فوسفاتاز القطب الجنوبي هو الأفضل؟ ج: يُعد Quick CIP (NEB #M0525) الخيار الأمثل لأنه يوفر بروتوكولًا سريعًا، ولا يتطلب أي إضافات، ويتميز بنشاط نوعي عالٍ. يُفضل Quick CIP على فوسفاتاز القطب الجنوبي لأنه لا يتطلب إضافة الزنك أو أي عوامل مساعدة أخرى في محلول التفاعل. ونتيجة لذلك، يمكن إضافة Quick CIP مباشرةً إلى نواتج هضم إنزيمات التقييد. بالإضافة إلى ذلك، بعد تعطيل هذا الإنزيم بالحرارة، لا داعي لتنقية الحمض النووي للناقل قبل تفاعل الربط. س: يبدو عدد المستعمرات التي لا تحتوي على قطعة مُدرجة مرتفعًا، كيف يمكنني التأكد من نجاح فوسفاتاز القطب الجنوبي؟ ج: يمكن استخدام الضوابط التالية لتشخيص هذه المشكلة: 1. ناقل غير مقطوع للتحقق من حيوية الخلايا واختبار مقاومة البلازميد للمضادات الحيوية. يُزرع على وسط غذائي ووسط غذائي مضاف إليه مضاد حيوي. ٢. قطع المتجه دون ربطه للتحقق من وجود متجه غير مقطوع. قد يلزم تنقية المتجه المقطوع باستخدام الجل (نوصي باستخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي من جل Monarch، NEB# T1020) لإزالة آخر ٠.١٪ من المتجه غير المقطوع. ٣. قطع المتجه وربطه: للتحقق من سلامة النهايات وظروف الربط. ٤. قطع المتجه وفوسفاتازه وربطه للتحقق من إزالة الفوسفات؛ يجب أن تكون نسبة القطع والربط ٣-٥٪ من المتجه. يجب أيضًا التحقق من ظروف الربط (الأسئلة الشائعة متوفرة لإنزيم T4 DNA ligase، NEB# M0202). س: هل يقوم Quick CIP أو rSAP أو فوسفاتاز القطب الجنوبي (AnP) بإزالة الفوسفات من البروتينات؟ ج: يمكن استخدام Quick CIP أو rSAP أو AnP لإزالة الفوسفات من البروتينات، ومع ذلك، توصي NEB باستخدام فوسفاتاز بروتين لامدا (Lambda PP، رقم كتالوج NEB: P0753)، وهو فوسفاتاز بروتين مزدوج ذو نطاق واسع جدًا من التخصص. س: هل يلزم تنقية الحمض النووي بعد الهضم الإنزيمي، قبل المعالجة بفوسفاتاز أنتاركتيكا؟ ج: في معظم الحالات، يعمل فوسفاتاز أنتاركتيكا بشكل جيد في تفاعل يحتوي على إنزيم التقييد، ولكن فقط عند إضافة محلول منظم لتفاعل فوسفاتاز أنتاركتيكا بتركيز 10X ليصل التركيز النهائي إلى 1X. يُنصح بتعطيل إنزيم التقييد بالحرارة إن أمكن. س: هل يلزم تنقية الحمض النووي بعد المعالجة بفوسفاتاز أنتاركتيكا؟ ج: لا. يُنصح بتعطيله بالحرارة لمدة دقيقتين عند 80 درجة مئوية أو 5 دقائق عند 70 درجة مئوية (أو حسب الحاجة لتعطيل إنزيم التقييد). إذا تعذر تعطيل إنزيم التقييد بالحرارة، فيجب تنقية الحمض النووي قبل عملية الربط. س: ما هو الوزن الجزيئي؟ ج: يبلغ وزن الإنزيم 70 كيلو دالتون؛ ومع ذلك، فإن الإنزيم عبارة عن ثنائي الوحدات ويبلغ وزنه 35 كيلو دالتون. س: هل يمكن تعطيل فوسفاتاز القطب الجنوبي بالحرارة؟ ج: نعم. يمكن تعطيله بالحرارة لمدة دقيقتين عند 80 درجة مئوية أو لمدة 5 دقائق عند 70 درجة مئوية. أو يمكن تسخينه حسب الحاجة لتعطيل إنزيم التقييد. س: ما هي مجموعات الفوسفات التي تتم إزالتها بواسطة rSAP أو Quick CIP أو فوسفاتاز القطب الجنوبي (AnP)؟ ج: تقوم إنزيمات rSAP وQuick CIP وAnP، كما هو الحال مع أي فوسفاتاز قلوي، بإزالة الفوسفات من نهايتي 5' و3' للحمض النووي DNA وRNA أحادي السلسلة وثنائي السلسلة، كما أنها تزيل الفوسفات من dNTPs. لا تمتلك الفوسفاتازات القلوية (بما في ذلك rSAP وQuick CIP وAnP) أي نشاط على بنية غطاء 5' للحمض النووي RNA. س: هل س: هل يلزم تنقية الحمض النووي بعد عملية الهضم بالإنزيمات المقيدة وقبل خطوة إزالة الفوسفات؟ ج: إذا كانت الإنزيمات المستخدمة في عملية الهضم بالإنزيمات المقيدة قابلة للتثبيط الحراري، فلا حاجة لخطوة التنقية. أما إذا كانت غير قابلة للتثبيط الحراري، فيُنصح بإجراء خطوة تنظيف بين عملية الهضم بالإنزيمات المقيدة وخطوة إزالة الفوسفات. س: هل يلزم تنقية الحمض النووي بعد خطوة إزالة الفوسفات وقبل خطوة الربط؟ ج: إذا استخدمتَ مجموعة إزالة الفوسفات السريعة (NEB #M0508) أو rSAP (NEB #M0371) أو فوسفاتاز القطب الجنوبي (NEB #M0289)، والتي يمكن تثبيطها حراريًا، فلا حاجة لخطوة التنظيف. أما إذا كان الفوسفاتاز القلوي المستخدم هو CIP، والذي لا يمكن تثبيطه حراريًا، فضرورة إجراء خطوة التنظيف (باستخدام مجموعة Monarch® PCR & DNA Cleanup Kit NEB #T1030). س: هل الفوسفاتاز القلوي هل الفوسفاتازات نشطة في محاليل NEBuffers؟ ج: إنزيم Quick CIP (NEB #M0525) وإنزيم rSAP (NEB #M0371) نشطان في جميع محاليل NEBuffers الخاصة بإنزيمات التقييد r1.1 وr2.1 وr3.1 ومحلول rCutSmart™ Buffer (NEB #B6004)، ويمكن إضافتهما مباشرةً إلى الحمض النووي المهضوم. يتطلب إنزيم فوسفاتاز القطب الجنوبي (NEB #M0289) وجود الزنك بشكل أساسي، ويبلغ نشاطه الأمثل عند درجة حموضة 6.0. يمكن استخدام إنزيم فوسفاتاز القطب الجنوبي في محاليل NEBuffers 1 و2 و3 و4، بالإضافة إلى محاليل NEBuffers الخاصة بإنزيمي EcoRI وBamHI فقط عند إضافته إلى محلول تفاعل فوسفاتاز القطب الجنوبي بتركيز 10X ليصل التركيز النهائي إلى 1X. س: مشكلة في الاستنساخ: وجود تشويش زائد في خطوة التحويل. ج: في حال وجود تشويش زائد في خطوة التحويل، من المهم حدد ما إذا كان هذا ناتجًا عن عدم كفاءة إزالة الفسفرة أو عن وجود بلازميد غير مهضوم متبقٍ من عملية الهضم الإنزيمي. لتحديد مصدر الإشارة الخلفية، أضف عينتين ضابطتين في خطوة التحويل: ناقل بدون ليغاز، وناقل منزوع الفسفرة مع ليغاز. إذا كان عدد المتحولات في العينة 1 كبيرًا، فهذا يدل على وجود بلازميد غير مقطوع في الحمض النووي للناقل. أما إذا كان عدد المتحولات في العينة 1 منخفضًا جدًا، بينما كان عددها في العينة 2 مرتفعًا، فهذا يدل على عدم كفاءة إزالة الفسفرة. إذا تبين أن خطوة إزالة الفسفرة هي المشكلة، فتأكد من إضافة الكمية الموصى بها من الفوسفاتاز لكل كمية موصى بها من الركيزة. كذلك، تأكد من الحضانة للمدة ودرجة الحرارة الموصى بهما. نوصي بتعطيل إنزيمات القطع حراريًا قبل خطوة إزالة الفسفرة، إذا كانت إنزيمات القطع المستخدمة قابلة للتعطيل الحراري. كما نوصي بتعطيل الفوسفاتاز حراريًا. قبل خطوة الربط. إذا تعذر تعطيل الفوسفاتاز المستخدم بالحرارة، فنوصي بتنقية الحمض النووي باستخدام عمود الفصل قبل خطوة الربط. يمكن تحقيق ذلك باستخدام مجموعة Monarch PCR & DNA Cleanup (5 ميكروغرام) (NEB #T1030).