مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، M0293S، إكسونوكلياز I (الإشريكية القولونية)

ملاحظة: انظر أيضًا مجموعة Exo-CIP™ لتنظيف تفاعل البوليميراز المتسلسل السريع ( الفئات ذات الصلة: الإكسونوكليازات والإندونيوكليازات غير النوعية). تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي تحفز إطلاق 10 نانومول من النيوكليوتيد القابل للذوبان في الأحماض في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر خلال 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في محلول تفاعل الإكسونوكلياز I بتركيز 1X مع 0.17 ملغم/مل من الحمض النووي أحادي السلسلة [3H]. شروط التفاعل : محلول تفاعل الإكسونوكلياز I بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول تفاعل الإكسونوكلياز I بتركيز 1X، 67 ملي مولار جليسين-KOH، 6.7 ملي مولار MgCl2، 10 ملي مولار β-ME (الأس الهيدروجيني 9.5 عند 25 درجة مئوية). تركيز الاستخدام: 10000 وحدة/مل. محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار NaCl 5 ملي مولار β-ME، 0.5 ملي مولار EDTA، 100 ميكروغرام/مل BSA، 50% جلسرين، درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية، تعطيل حراري عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. الأسئلة الشائعة : س: هل يمكن استخدام إكسونوكلياز I لإزالة البادئات من تفاعلات التضخيم؟ ج: يقوم إكسونوكلياز I بتحليل فائض قليل النوكليوتيدات أحادية السلسلة من خليط التفاعل الذي يحتوي على منتجات ثنائية السلسلة. س: هل يقوم إكسونوكلياز I بتحليل الحمض النووي الريبي (RNA)؟ ج: لا. س: هل يمكن استخدام إكسونوكلياز I لتسوية نهايات الحمض النووي (DNA)؟ ج: لا. النهايات القصيرة ليست ركيزة. استخدم بوليميراز الحمض النووي I، الجزء الكبير (Klenow) (NEB# M0210) لملء النهايات المتدلية 5' (وتسمى أيضًا النهايات المتراجعة 3') وقم بإزالة النهايات المتدلية 3' أو استخدم نوكلياز فول المونج (NEB# M0250) لإزالة النهايات 3' أو امتدادات بطول 5 أقدام. ملاحظة: لا يمكن ملء الامتدادات بطول 3 أقدام. س: هل يمكن تعطيل إنزيم إكسونوكلياز I بالحرارة؟ ج: نعم. يُعطل بالحرارة عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. س: هل يعمل إنزيم إكسونوكلياز I في محاليل منظمة أخرى؟ ج: نعم. في التطبيقات الشائعة، يعمل إنزيم إكسونوكلياز I في محاليل NEBuffers من 1 إلى 4 وفي محاليل البوليميراز. س: هل يمكن استخدام إنزيم إكسونوكلياز I مع إنزيم إكسونوكلياز ثنائي السلاسل لتنظيف مستحضرات البلازميد؟ ج: يمكن استخدام إنزيم إكسونوكلياز I مع إنزيم لامدا إكسونوكلياز (NEB# M0262) لتنظيف مستحضرات البلازميد. كما يعمل إنزيم إكسونوكلياز III (NEB# M0206) وإنزيم T7 إكسونوكلياز (NEB# M0263)، ولكنهما يُتلفان البلازميدات المقطوعة. على الرغم من إمكانية استخدام إنزيم إكسونوكلياز I، إلا أننا نوصي باستخدام إنزيم إكسونوكلياز V (RecBCD) (NEB #M0345). لإزالة الحمض النووي الصبغي بعد تحضير البلازميد (انظر ملاحظة التطبيق الخاصة بنا: استخدام Exonuclease V (RecBCD) للتخلص من الحمض النووي الجينومي المتبقي عند تنقية البلازميدات منخفضة النسخ باستخدام مجموعة Monarch® Plasmid Miniprep Kit).