مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، M0301S، توبويزوميراز I (الإشريكية القولونية)

الفئات ذات الصلة: إنزيمات إصلاح الحمض النووي وإنزيمات النوكلياز الداخلية المتخصصة بالبنية. تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة بأنها كمية الإنزيم التي تحفز استرخاء أكثر من 95% من 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي pUC19 RF I (المُلتفّ بشكل فائق سلبيًا) خلال 15 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 25 ميكرولتر. يتم تقييم الالتفاف الفائق للحمض النووي بواسطة الرحلان الكهربائي على هلام الأغاروز في غياب بروميد الإيثيديوم. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محلول التخزين NEBuffers : 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 35 ملي مولار كبريتات الأمونيوم، 50 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 1 ملي مولار داي ثيو ثريتول، 0.1 ملي مولار إيديتات ثنائي الصوديوم، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. الأسئلة الشائعة : س: هل يُرخي إنزيم توبويزوميراز I جميع جزيئات الحمض النووي فائقة الالتفاف بنفس الدرجة، أم أن النواتج عبارة عن توازن بين مختلف التكوينات؟ ج: يُرخي إنزيم توبويزوميراز I البلازميدات فائقة الالتفاف السالبة. سيكون هناك بعض التباين في عدد الروابط لجزيئات الحمض النووي المُرخاة، والتي ستتوزع حول التكوين الأكثر تفضيلاً. إن الفرق في الطاقة بين جزيئات الحمض النووي ذات أعداد الروابط المختلفة صغير جدًا، وستتوزع حول متوسط. لذلك، على هلام الأغاروز بدون بروميد الإيثيديوم، سيُلاحظ توزيع للحزم حتى في حالة اكتمال التفاعل. يجب أن تتحرك هذه الحزم ببطء، ويمكن تمييزها بسهولة عن البلازميدات فائقة الالتفاف. س: إذا تم تشغيل الحمض النووي الناتج عن تفاعل توبويزوميراز I في هلام بروميد الإيثيديوم، ولم يظهر أي دليل على نشاط الإنزيم، فما هو التفسير الأكثر ترجيحًا؟ ج: يتخلل بروميد الإيثيديوم قواعد الحمض النووي ويحفز الالتفاف الفائق. ستصبح جميع البلازميدات المُرخاة، بغض النظر عن عدد الروابط، فائقة الالتفاف في وجود بروميد الإيثيديوم، وستظهر وكأنها تتحرك في نفس الموضع المكافئ لأي حمض نووي فائق الالتفاف في العينة. لذا، للتحقق من نتيجة تفاعل توبويزوميراز I، يجب فصل النواتج باستخدام هلام كهربائي خالٍ من بروميد الإيثيديوم. بعد الفصل، يمكن تلوين الهلام ببروميد الإيثيديوم لتصوير الحمض النووي. ستتحرك الأشكال غير الملتفة من البلازميد ببطء في الجزء العلوي من الهلام، بينما ستتحرك الأشكال الملتفة بشدة بسرعة أكبر في الجزء السفلي. س: ما هو الوزن الجزيئي لتوبويزوميراز I؟ ج: الوزن الجزيئي لتوبويزوميراز I هو 97.4 كيلو دالتون. س: هل يستطيع توبويزوميراز I فك التفاف الحمض النووي الموجب والسالب؟ ج: لا، توبويزوميراز I من الإشريكية القولونية يفك التفاف الحمض النووي السالب فقط. س: هل يمتلك توبويزوميراز I من الإشريكية القولونية نفس خصائص توبويزوميراز I من فيروس الوقس؟ ج: لا، توبويزوميراز I من الإشريكية القولونية يفك التفاف الحمض النووي السالب فقط. إنزيم توبويزوميراز I من فيروس الوقس قادر على إرخاء الحمض النووي فائق الالتفاف، سواءً كان سالبًا أو موجبًا. س: هل يُحدث إنزيم توبويزوميراز I كسورًا في أحد خيوط البلازميد؟ ج: لا تحتوي البلازميدات التي يُرخيها إنزيم توبويزوميراز I على كسور في أحد خيوطها. وستبقى أي بلازميدات ممزقة موجودة مسبقًا على حالها في العينة. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن استبدال الألبومين البقري (BSA) بالألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ شركة NEB أن تُعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1، وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1، وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. نشعر أن الابتعاد عن المنتجات التي تحتوي على مكونات حيوانية هو خطوة في الاتجاه الصحيح، ونحن قادرون على تقديم هذا التحسين بنفس السعر.