مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، M0302S، إندونوكلياز T7 I

الفئات ذات الصلة التحقق من صحة تحرير الجينات القائم على تقنية CRISPR، والإكسونوكليازات والإندونوكليازات غير المحددة، وإنزيمات إصلاح الحمض النووي والإندونوكليازات المحددة للبنية. التطبيقات: تضخيم الجينوم الكامل وتضخيم الإزاحة المتعددة. تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لتحويل أكثر من 90% من 1 ميكروغرام من pUC(AT) الصليبي فائق الالتفاف إلى أكثر من 90% من الشكل الخطي في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول NEBuffer™ 2 بتركيز 1X، يُحضن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. محلول NEBuffer™ 2 بتركيز 1X، 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 10 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 1 ملي مولار DTT (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 20 ملي مولار Tris-HCl، 200 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، 0.15% Triton® X-100، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري : لا. الأسئلة الشائعة : س: هل هناك طريقة لتعطيل إنزيم T7 Endonuclease I؟ ج: نعم، لتعطيل إنزيم T7 Endonuclease I، نوصي باستخدام بروتينيز K والتحضين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. يرجى الاطلاع على البروتوكول: "الكشف عن الطفرات باستخدام إنزيم T7 Endonuclease I مع مجموعة EnGen® للكشف عن الطفرات" لمزيد من التفاصيل. س: هل يتعرف إنزيم T7 Endonuclease I على عدم تطابق زوج القاعدة المفرد؟ ج: على الرغم من أن إنزيم T7 Endonuclease I فعال على الحمض النووي غير المتطابق، إلا أنه ليس الإنزيم الأمثل لقطع جميع حالات عدم تطابق زوج القاعدة المفرد في الحمض النووي الهجين. اعتمادًا على حالات عدم التطابق في تجربتك، قد تلاحظ كفاءات قطع مختلفة (Guan, C. et al. (2004) Biochemistry, 43, 4313-4322). قد لا يكون إنزيم T7 Endonuclease I الخيار الأمثل للكشف عن حالات عدم التطابق ذات التركيب غير المعروف. مع ذلك، إذا كان من المعروف أن حالة عدم التطابق تحتوي على السيتوزين (C)، فيمكنك استخدام هذا الإنزيم في فحصك. نوصي بمعايرة الإنزيم لتحسين عملية القطع. س: ما هي الإضافات الشائعة التي تثبط إنزيم T7 Endonuclease I؟ ج: يتطلب إنزيم T7 Endonuclease I وجود أيونات المغنيسيوم (Mg2+) أو المنغنيز (Mn2+) لكي يعمل. ويعمل عامل مخلبي، مثل EDTA، على تثبيط التفاعل. س: ما هو الوزن الجزيئي لإنزيم T7 Endonuclease I؟ ج: إنزيم T7 Endonuclease I المُورَّد مُدمج مع بروتين ربط المالتوز الخاص ببكتيريا الإشريكية القولونية. ويبلغ الوزن الجزيئي للبروتين المُدمج بالكامل 60302 دالتون. س: ما هي كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) التي توصون بها لتضخيم الحمض النووي في فحوصات الكشف عن عدم تطابق الحمض النووي في تقنيات تحرير الجينوم (CRISPR/Cas9، TALEN، ZFN)؟ ج: نوصي باستخدام بوليميراز الحمض النووي Q5® عالي الدقة مع محلول التفاعل Q5® أو مزيج Q5 Hot Start High Fidelity 2X Master Mix نظرًا لدقة بوليميرازات الحمض النووي Q5 العالية وقوتها. وتوفر مجموعة EnGen للكشف عن الطفرات كواشف للكشف عن أحداث تحرير الجينوم المستهدفة. تأتي المجموعة مع إنزيمات مُحسَّنة (بما في ذلك كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل PCR)، وبروتوكولات، وتتضمن عينة تحكم. ملاحظات: إنزيم T7 Endonuclease I هو إنزيم انتقائي للبنية. يعمل على مجموعة متنوعة من ركائز الحمض النووي DNA بأنشطة نوعية مختلفة. من المهم التحكم في كمية الإنزيم ووقت التفاعل المستخدم لقطع ركيزة معينة. تؤدي درجات الحرارة التي تزيد عن 42 درجة مئوية إلى زيادة نشاط النيوكلياز غير النوعي، ويجب تجنبها. يُشتق pUC(AT) من pUC19 مع تعديل الرابط المتعدد بين موقع EcoRI وموقع PstI. سؤال: هل يمكنني استخدام فحوصات الكشف عن عدم تطابق الحمض النووي لتقنية تحرير الجينوم T7 Endonuclease I (CRIPSR/Cas9، TALEN، ZFN) باستخدام منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل PCR غير المنقاة؟ ج: نوصي باستخدام 1-4 ميكرولتر من تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) المناسب مباشرةً في 50 ميكرولتر من تفاعل إنزيم T7 Endonuclease I عند استخدام كواشف PCR التالية: - بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5® مع محلول التفاعل Q5® - بوليميراز الحمض النووي OneTaq®. في هذه الحالة، يُعد تنقية نواتج PCR قبل هضمها باستخدام إنزيم T7 Endonuclease I اختياريًا. لتنقية نواتج PCR، نوصي باستخدام مجموعة Monarch PCR & DNA Cleanup. س: هل يمكنني استخدام إنزيم T7 Endonuclease I لتطبيقات تحرير الجينوم؟ ج: نعم. يمكن استخدام إنزيم T7 Endonuclease I للكشف عن تكوين الحذف والإدخال (أحداث التحرير المستهدفة) في عمليات تحرير الجينوم. توفر مجموعة EnGen® للكشف عن الطفرات كواشف للكشف عن أحداث تحرير الجينوم المستهدفة. تحتوي المجموعة على إنزيم T7 Endonuclease I بتركيبة مُحسَّنة، بالإضافة إلى كواشف PCR اللازمة، وركيزة التحكم، والبروتوكولات. يمكن شراء إنزيم T7 Endonuclease I ككاشف مستقل. يُرجى الرجوع إلى هذا البروتوكول عند استخدام هذا المنتج. س: ما هو الوزن الجزيئي لإنزيم T7 Endonuclease I؟ ج: إنزيم T7 Endonuclease I المُورّد مُدمج مع بروتين ربط المالتوز الخاص ببكتيريا الإشريكية القولونية. يبلغ الوزن الجزيئي للبروتين المُدمج بالكامل 60302 دالتون. س: ما هي كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) التي توصون بها لتضخيم الحمض النووي في فحوصات الكشف عن عدم تطابق الحمض النووي في تقنيات تحرير الجينوم (CRISPR/Cas9، TALEN، ZFN)؟ ج: نوصي باستخدام بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5® مع محلول التفاعل Q5® أو مزيج Q5 Hot Start High Fidelity 2X Master Mix. إن دقة وقوة بوليميراز الحمض النووي Q5 تجعله خيارًا جيدًا لهذا الفحص. توفر مجموعة EnGen® للكشف عن الطفرات كواشف للكشف عن أحداث تحرير الجينوم المستهدفة. تأتي المجموعة مع إنزيم مُحسَّن (بما في ذلك كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل)، وبروتوكولات، وتتضمن عنصر تحكم.