مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، M0303S، دي إن إيه 1 (خالي من إنزيم RNase)

الفئات ذات الصلة: تحليل الكروماتين، الإكسونوكليازات والإندونوكليازات غير المتخصصة، تخليق الحمض النووي الريبي (RNA) والنسخ في المختبر (IVT)، التطبيقات: استنساخ الحمض النووي الريبي (RNA). المواصفات: المواد المطلوبة (غير متوفرة ): ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500)، مثبط إنزيم RNase، فأري (NEB #M0314)، EDTA. تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي تُحلل 1 ميكروغرام من الحمض النووي pBR322 بشكل كامل خلال 10 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في محلول تفاعل DNase I. يُعرَّف التحلل الكامل بأنه اختزال غالبية شظايا الحمض النووي إلى رباعيات النيوكليوتيدات أو أصغر. شروط التفاعل: محلول تفاعل DNase I بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول تفاعل DNase I بتركيز 1X: 10 ملي مولار Tris-HCl، 2.5 ملي مولار MgCl2، 0.5 ملي مولار CaCl2 (الأس الهيدروجيني 7.6 عند 25 درجة مئوية). تركيز الاستخدام: 2000 وحدة/مل. محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 2 ملي مولار CaCl2، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.6 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الأسئلة الشائعة : س: ما هو النشاط النوعي لإنزيم DNase I (الخالي من RNase)؟ ج: النشاط النوعي حوالي 20000 وحدة/ملغ. س: هل يعمل إنزيم DNase I في محاليل NEB من 1 إلى 4؟ ج: نعم، ولكن ليس بنفس الكفاءة. إنزيم DNase I هو إنزيم يعتمد على الكالسيوم، لذا فهو يعمل بشكل أفضل في محلوله الخاص الذي يحتوي على كلوريد الكالسيوم. يُنصح بإضافة محلول منظم DNase I أو 0.5 ملي مول من كلوريد الكالسيوم (CaCl2) إلى التفاعل حتى عند استخدام محاليل NEB المنظمة من 1 إلى 4. كما أن DNase I لا يعمل بكفاءة في المحاليل عالية الملوحة، كما هو الحال في محلول NEB المنظم رقم 3. يكون أداؤه أقل فعالية في هذا المحلول، ولكنه مع ذلك يُحقق هضمًا بنسبة 50-75%. س: ما هي أفضل طريقة لإزالة DNase I من التفاعل؟ ج: أفضل طريقة لإزالة DNase I من التفاعل هي إجراء استخلاص بالفينول/الكلوروفورم أو استخدام عمود طرد مركزي. يمكنك إجراء خطوة التثبيط الحراري، ولكن قد لا تُزيل DNase I بالكامل، وقد تتداخل مع التطبيقات اللاحقة. س: هل يعمل DNase I في محلول rCutSmart المنظم؟ ج: نعم، يعمل DNase I في محلول rCutSmart المنظم، مع إضافة الكالسيوم. للاطلاع على نسبة نشاطه الوظيفي في rCutSmart، ونسبة نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي الأخرى في عملية الاستنساخ، يُرجى الرجوع إلى مخطط نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي في محلول rCutSmart®. س: هل يُمكنني استخدام مجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kit لتنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA) المُعالج بإنزيم DNase I؟ ج: نعم، ستُزيل مجموعات Monarch Spin RNA Cleanup Kit أي نشاط متبقٍ لإنزيم DNase I (NEB #M0303) من عينات الحمض النووي الريبوزي. قد تُؤدي المعالجة بإنزيم DNase I على العمود إلى بقاء نشاط متبقٍ، لذا لا نوصي باستخدام مجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kit على العمود، بل نوصي بمعالجة الحمض النووي الريبوزي بإنزيم DNase I في المحلول قبل تنقية الحمض النووي الريبوزي.