مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، M0305S، إندونوكلياز V

الفئات ذات الصلة: إنزيمات إصلاح الحمض النووي وإنزيمات النوكلياز الداخلية المتخصصة بالبنية. تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لقطع 1 بيكومول من جزيء أوليغونوكليوتيد مزدوج مكون من 34 قاعدة، يحتوي على موقع ديوكسي إينوزين واحد*، في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر خلال ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. * يُحضَّر موقع الديوكسي إينوزين صناعيًا بوجود dl في منتصف أحد خيوط جزيء أوليغونوكليوتيد مزدوج مكون من 34 قاعدة. شروط التفاعل: محلول NEBuffer™ 4 بتركيز 1X، يُحضن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. محلول NEBuffer™ 4 بتركيز 1X، يحتوي على: 50 ملي مولار من أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار من أسيتات التريس، 10 ملي مولار من أسيتات المغنيسيوم، 1 ملي مولار من ثنائي ثيوثريتول (DTT) (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 ملي مولار من تريس-هيدروكلوريد، 250 ملي مولار من كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي مولار من إيديتات ثنائي الصوديوم (EDTA)، 50% جلسرين، 0.15% تريتون® X-100، 1 ملي مولار من ثنائي ثيوثريتول (DTT)، 200 ميكروغرام/مل من ألبومين المصل البقري (BSA) عند درجة حموضة 8 ودرجة حرارة 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. شروط فحص الوحدة : محلول NEBuffer™ 4 بتركيز 1X يحتوي على 10 بيكومول من ثنائي أوليغونوكليوتيد موسوم بالفلورسنت في حجم إجمالي قدره 10 ميكرولتر. الأسئلة الشائعة : س: ما هو الوزن الجزيئي لإنزيم إندونوكلياز V؟ ج: يبلغ الوزن الجزيئي لإنزيم NEB Endonuclease V 80 كيلو دالتون لأنه يُنتج كبروتين اندماجي مع بروتين MBP (الوزن الجزيئي لبروتين MBP = 55 كيلو دالتون). س: ما الركيزة المستخدمة لاختبار نشاط إنزيم Endonuclease V؟ ج: الركائز التي نستخدمها لاختبار نشاط الإنزيم مُدرجة ضمن تعريف وحدة كل إنزيم. في حالة إنزيم Endonuclease V، يُستخدم جزيء أوليغونوكليوتيد مزدوج مكون من 34 قاعدة يحتوي على موقع ديوكسي إينوزين واحد. س: ما هو نشاط إنزيم Endonuclease V في محاليل NEBuffers المختلفة؟ ج: نشاط إنزيم Endonuclease V في محاليل NEBuffers كما يلي: محلول NEBuffer 1: 75% نشاط؛ محلول NEBuffer 2: 50% نشاط؛ محلول NEBuffer 3: 100% نشاط؛ محلول NEBuffer 4: 100% نشاط. س: ما مدى كفاءة إنزيم Endonuclease V في قطع مواقع U:A؟ ج: لا يعمل إنزيم إندونوكلياز V بكفاءة في مواقع U:A. مع ذلك، فإنه يقطع الرابطة الفوسفودايسترية 3' لقاعدة ديوكسي يوريدين غير المتطابقة في حالة عدم تطابق U:G. لمزيد من المعلومات، يُرجى مراجعة صفحة "إنزيمات غليكوزيلاز إصلاح الحمض النووي على قواعد التلف المختلفة" على موقعنا الإلكتروني. س: هل يستطيع إنزيم إندونوكلياز V قطع الحلقة في بنية الحمض النووي ذات الحلقة الجذعية؟ ج: نعم، أُفيد أن إنزيم إندونوكلياز V قادر على قطع الحلقة في بنية الحمض النووي ذات الحلقة الجذعية. س: هل يمكن إصلاح القطع الناتج عن نشاط إنزيم إندونوكلياز V باستخدام إنزيم ربط الحمض النووي؟ ج: نعم، يمكن ربط القطع الناتج عن إنزيم إندونوكلياز V بواسطة إنزيم ربط الحمض النووي. س: هل يستطيع إنزيم إندونوكلياز V التعرف على عدم التطابق وقطعه؟ ج: نعم، سيتعرف إنزيم إندونوكلياز V على عدم التطابق. مع ذلك، فإن كفاءة القطع في هذه المواقع منخفضة جدًا. س: ما الفرق بين الإندونوكلياز V (#M0305) والإندونوكلياز Q المقاوم للحرارة (#M0701)؟ ج: على الرغم من أن كلا الإندونوكلياز V والإندونوكلياز Q المقاوم للحرارة يتعرفان على ديوكسي إينوزين في ركائز الحمض النووي، مما يؤدي إلى تكوين شق يحتوي على مجموعة هيدروكسيل 3′ ومجموعة فوسفات 5′، إلا أن موقع هذا الشق يختلف. يقوم الإندونوكلياز V بقطع الرابطة الفوسفودايسترية الثانية على الجانب 3′ من ديوكسي إينوزين؛ بينما يقوم الإندونوكلياز Q المقاوم للحرارة بقطع الرابطة الفوسفودايسترية الموجودة مباشرةً على الجانب 5′ من ديوكسي إينوزين. إضافةً إلى ذلك، يكون نشاط الإندونوكلياز V في أفضل حالاته عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، ويمكن تعطيله بالحرارة؛ أما نشاط الإندونوكلياز Q المقاوم للحرارة فيكون في أفضل حالاته بين 65 و85 درجة مئوية، ولا يمكن تعطيله بالحرارة.