نيو إنجلاند بيولابس، M0309S، مزيج إصلاح PreCR®

استعادة عينات الحمض النووي التالفة أو المتضررة أو المتدهورة. الفئات ذات الصلة : معالجة الحمض النووي، إنزيمات إصلاح الحمض النووي، والنوكليازات الداخلية المتخصصة بالبنية. التطبيقات: تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). الأسئلة الشائعة حول تفاعل البوليميراز المتسلسل: س: هل يقوم PreCR بربط شظايا الحمض النووي الخاصة بي؟ ج: إنزيم الربط الموجود في مزيج إصلاح PreCR هو Taq DNA ligase (NEB #M0208). يعمل هذا الإنزيم على سد الشقوق في الحمض النووي بكفاءة، ولكنه غير فعال في ربط الشظايا غير المتطابقة أو في ربط الحمض النووي ذي النهايات غير المتطابقة. في الواقع، لم نلاحظ أبدًا أن هذا الإنزيم يقوم بربط الحمض النووي ذي النهايات غير المتطابقة. س: ما مقدار الحمض النووي الذي يمكن إصلاحه بواسطة PreCR؟ ج: على الرغم من أننا نوصي بما يصل إلى 500 نانوغرام في بطاقة البيانات، إلا أن هذا مجرد تعميم. تعتمد كمية الحمض النووي التي يمكن إصلاحها على العديد من العوامل، مثل نوع التلف أو الأضرار والكمية الإجمالية للتلف. لقد أصلحنا 1 ميكروغرام من الحمض النووي باستخدام 1 ميكرولتر من مزيج إنزيمات PreCR Repair Mix، ولا نعتبر هذا الحد الأقصى الفعلي. والسؤال الآخر هو: ما هي كمية الحمض النووي الآمنة للاستخدام مع PreCR Repair Mix؟ لم نجد حدًا أدنى لتركيز الحمض النووي اللازم للإصلاح. عادةً، لا يُشكل تركيز الحمض النووي في تفاعل PreCR Repair Mix مصدر قلق كبير لإجراء التفاعل. س: هل ستؤثر معالجة الحمض النووي الخاص بي بـ PreCR Repair Mix سلبًا على التفاعل؟ ج: لا. لم نلاحظ أي تأثير سلبي لـ PreCR Repair Mix على تفاعل PCR. نظرًا لتعقيد تلف الحمض النووي، قد توجد حالات لم نصادفها يكون فيها لمعالجة PreCR تأثير سلبي. أحد السيناريوهات المحتملة لذلك هو حالة يكون فيها الحمض النووي المتضرر أحادي السلسلة في الغالب. يمكن لبعض إنزيمات الإصلاح أن تعمل على الحمض النووي أحادي السلسلة، لكن هذا الحمض النووي يفتقر إلى السلسلة المكملة اللازمة للإصلاح الكامل. س: ما هو تسلسل مزيج بادئات L1؟ ج: يحتوي المزيج على بادئ أمامي وبادئ عكسي. تسلسل البادئات هو: CCTGCTCTGCCGCTTCACGC و GATGACGCATCCTCACGATAATATCCGG للبادئ الأمامي والبادئ العكسي على التوالي. تم وصف هذه البادئات في Wang, Y., et al., Nucleic Acids Res. (2004) 32(3):1197. س: كيف يتم إنتاج الحمض النووي التالف الذي تختبرون عليه مزيج إصلاح PreCR؟ هل يمكنني شراء هذا الحمض النووي التالف بشكل منفصل؟ ج: لقد اختبرنا مزيج إصلاح PreCR على حمض نووي يحتوي على مواقع خالية من القواعد، وقواعد مؤكسدة، وتلف ناتج عن الأشعة فوق البنفسجية، و dU، بالإضافة إلى الحمض النووي المتضرر بالحرارة. يتم توليد المواقع الخالية من القواعد عن طريق الحضانة عند درجة حموضة 5 كما هو موضح في Ide, H., et al. (Biochemistry (1993) 32(32):8276-83). يتسارع تأكسد الحمض النووي بواسطة الميثيلين الأزرق (Boiteux, S., et al, (1992) 31(1):106-110). يحدث تلف الحمض النووي نتيجة التعرض للأشعة فوق البنفسجية. يُستخلص الحمض النووي البلازميدي المحتوي على dU من سلالة dut-/ung- من بكتيريا الإشريكية القولونية K12 CJ236 (NEB#E4141). يتوفر الحمض النووي المتضرر بالأشعة فوق البنفسجية من NEB فقط كجزء من مجموعة PreCR Repair Mix. س: لماذا لا يُعطي تفاعل التحكم الخاص بي ناتج تضخيم قابل للكشف؟ ج: حاول زيادة عدد الدورات من 25 إلى 30. س: هل يمكنني شراء أي من مكونات PreCR Repair Mix بشكل منفصل؟ ج: المكونان غير المباعين بشكل منفصل هما: مزيج بادئ L1 والحمض النووي لامدا المتضرر بالأشعة فوق البنفسجية. س: هل سيؤدي PreCR Repair Mix إلى إزالة نهايات الحمض النووي؟ ج: لا. سيقوم إنزيم البوليميراز الموجود في PreCR، Bst polI، بملء النهايات المتدلية 5'، لكنه لن يزيل النهايات المتدلية 3'. علاوة على ذلك، سيضيف هذا البوليميراز dA إلى الطرف 5' الممتلئ. إذا رغبت في الحصول على شظايا DNA ذات نهايات غير لاصقة بعد معالجة PreCR، فاستخدم البروتوكول التالي: بروتوكول إزالة النهايات غير اللاصقة. يستخدم هذا البروتوكول محلول الإصلاح الأمثل (محلول ThermoPol)، ولكن من الأفضل تنظيف DNA قبل إجراء تفاعل إزالة النهايات غير اللاصقة لسببين: 1) سيضيف بوليميراز Bst، إذا كان نشطًا، dA إلى DNA ذي النهايات غير اللاصقة، وبالتالي سينافس البوليميراز المُختار لإجراء تفاعل إزالة النهايات غير اللاصقة. 2) إذا كان DNA ذو النهايات غير اللاصقة بحاجة إلى فسفرة باستخدام T4 PNK، فيجب إزالة (NH4)2SO4 الموجود في محلول ThermoPol لأنه معروف بتثبيط T4 PNK. يبدأ البروتوكول بإجراء تفاعل إصلاح DNA كما هو موضح في بطاقة بيانات PreCR Repair Mix. بعد الإصلاح، يجب تنقية DNA، أي باستخدام عمود الطرد المركزي أو الترسيب بالإيثانول. يُخضع DNA المنقى لعملية إزالة النهايات غير اللاصقة. لإزالة النهايات غير المتطابقة من الحمض النووي، نوصي باستخدام مجموعة Quick Blunting Kit (NEB#E1201). ولإزالة النهايات غير المتطابقة وربطها، قامت NEB بتجميع مجموعتي Quick Blunting و Quick Ligation Kit (NEB#E0542) بشكل ملائم. س: لماذا لا أرى الشريط المتوقع من القالب المُصلح؟ ج: هناك عدة أسباب محتملة. أولًا، يُنصح، إن أمكن، بالتأكد من تحسين تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) باستخدام قالب حمض نووي جديد. على سبيل المثال، إذا كنت تُضخّم الحمض النووي من عينات عثة متحللة، فتحقق من تفاعل البلمرة المتسلسل باستخدام عينة حمض نووي جديدة من نفس النوع. ثانيًا، قد توجد مثبطات لتفاعل البلمرة المتسلسل في الحمض النووي المُستخلص. يمكن اختبار ذلك باستخدام تفاعل بلمرة متسلسل معروف بفعاليته، ثم إضافة جزء من الحمض النووي المُستخلص. إذا تم تثبيط تفاعل البلمرة المتسلسل بوجود الحمض النووي المُستخلص، فقد تكون مثبطات تفاعل البلمرة المتسلسل هي السبب. في هذه الحالة، تأكد من استخدام الألبومين في تفاعلات الإصلاح والتضخيم، لأن الألبومين معروف بقدرته على تخفيف آثار بعض أنواع مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). هناك طريقة أخرى بسيطة وفعالة، وهي إجراء سلسلة من تفاعلات PCR حيث يكون قالب الحمض النووي المستخلص موجودًا بتراكيز مختلفة. الفكرة هي إيجاد التركيز الذي يكون فيه المثبط مخففًا بما يكفي للسماح بتفاعل PCR، مع وجود كمية كافية من قالب الحمض النووي للسماح بالتضخيم. من المشاكل الأخرى أن يكون الحمض النووي متحللًا جدًا بحيث لا يمكن استعادته، أو أن الضرر الموجود لا يتم إصلاحه بواسطة مزيج إصلاح PreCR، أي الروابط المتشابكة بين الحمض النووي والبروتين. س: هل المحلول المنظم الخاص بي متوافق، وأي تفاعل يجب أن أستخدم؟ ج: إذا كان المحلول المنظم الخاص بك أحد الأنواع التالية: Thermopol، أو Taq القياسي، أو Phusion HF، أو Phusion GC، أو DyNazyme Ext buffer، فيمكنك استخدام البروتوكول القياسي. أما إذا كان المحلول المنظم الخاص بك أحد الأنواع التالية: AccuTaqLA، أو Pfu، أو iTaq، أو Accu-prime Pfx، فاستخدم بروتوكول التفاعل المتسلسل. س: هل يُدخل مزيج إصلاح PreCR نيوكليوتيدات عشوائية في التسلسل الذي يُصلحه؟ ج: لا، يُضيف البوليميراز الموجود في المزيج القواعد المُكملة التي تُطابق قاعدة القالب. لن يُدخل مزيج الإصلاح أي تغييرات على التسلسل. س: هل يحتوي مزيج إصلاح PreCR على أي حمض نووي بشري مُلوث؟ ما هي ضوابط الجودة المُستخدمة لاختبار ذلك؟ ج: مزيج إصلاح PreCR غير مُعتمد على أنه خالٍ من الحمض النووي البشري. تُجرى جميع فحوصات ضوابط الجودة على حمض نووي من بكتيريا الإشريكية القولونية، وليس على ركائز بشرية. س: هل يُزيل مزيج إصلاح PreCR التعديلات التساهمية من قواعد الحمض النووي، مثل البيوتين أو الديجوكسيجينين؟ هل يُصلح عدم التطابق/القواعد الزائدة في الحمض النووي؟ ج: لن يُزيل مزيج الإصلاح هذا التعديلات التساهمية في قواعد الحمض النووي. سيُصلح تلف الحمض النووي الأساسي مثل المواقع الخالية من القاعدة، والشقوق، وثنائيات الثايمين، والسيتوزين منزوع الأمين، والجوانين المؤكسد، والبيريميدين. كما أنه يُحسّن الطرف 3' باتجاه مجموعة الهيدروكسيل إذا كان هناك انسداد في هذا الطرف. إذا كانت حالات عدم التطابق تندرج ضمن هذه الفئات، فإن PreCR سيُصلحها. وإلا، فلا. س: إذا كانت هناك فجوات وشقوق متبقية من تفاعل الربط، فهل سيُصلحها مزيج PreCR Repair Mix جميعها، بحيث يكون الحمض النووي مناسبًا للحقن المجهري في الفئران، على سبيل المثال؟ ج: إن بوليميراز الحمض النووي Bst كامل الطول هو بوليميراز الحمض النووي الموجود في مزيج PreCR Repair Mix. يقوم هذا البوليميراز بملء الفجوات وإزالة القواعد التالفة عند توجيهه بواسطة إنزيمات الإصلاح الموجودة في المزيج. إن بوليميراز الحمض النووي Bst قادر على القيام بذلك لأنه يمتلك نشاط إكسونوكلياز 5'-3'، بالإضافة إلى نشاط بوليميراز الحمض النووي. ومع ذلك، فهو لا يمتلك نشاط إكسونوكلياز 3'-5'، المعروف أيضًا بنشاط التدقيق. س: هل يمكن استخدام مزيج PreCR Repair Mix مع الحمض النووي المُضمّن في البارافين؟ ج: لن يعمل مزيج PreCR Repair Mix مع العينات المُثبّتة. إذا أمكن استخلاص الحمض النووي من العينات المثبتة، فيمكن استخدام مزيج إصلاح PreCR لإصلاح الحمض النووي المنقى. س: سيُستخدم الحمض النووي المُصلح في عملية هضم باستخدام إنزيم Nsp1 أو Sty1، متبوعة بربط المحول، ثم تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). هل توصون بتنظيف تفاعل مزيج إصلاح PreCR قبل هذه العملية؟ ج: إذا كان إنزيم البوليميراز في مزيج إصلاح PreCR لا يزال موجودًا ونشطًا عند تكوين نهايات الحمض النووي بواسطة هضم إنزيم التقييد، فقد يُعدّل تلك النهايات (إما بملء الجزء البارز أو بإضافة dA غير مُستنسخ بطريقة مشابهة لإنزيم Taq DNA بوليميراز) ويتداخل مع الخطوات اللاحقة. لذلك، يُوصى بخطوة تعقيم حراري (80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة) أو خطوة تنظيف الحمض النووي. بعد ذلك، يمكن ترسيب الحمض النووي بالإيثانول أو تنقيته باستخدام عمود طرد مركزي. س: هل يستطيع مزيج إصلاح PreCR إصلاح التلف في كل من الحمض النووي أحادي السلسلة وثنائي السلسلة؟ أم أنه يتطلب حمضًا نوويًا ثنائي السلسلة كقالب؟ ج: يُستخدم مزيج إصلاح PreCR مع الحمض النووي المزدوج. بعض إنزيمات إصلاح الحمض النووي الموجودة في المزيج قادرة على التعرف على التلف في الحمض النووي أحادي السلسلة، لكن خطوات البلمرة والربط تتطلب الحمض النووي المزدوج. س: هل إضافة النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs) ضرورية لكي يعمل مزيج إصلاح PreCR بشكل صحيح؟ ج: نعم. سيتأثر الإصلاح إذا لم تُضَف النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات. س: إذا كان لديّ قالب حمض نووي يحتوي على مواقع طفرات (مثل 8-أوكسي غوانين أو سيتوزين منزوع الأمين) متجاورة مباشرة على سلسلتين متقابلتين، فهل سيؤدي العلاج بمزيج إصلاح PreCR إلى حدوث قطع/كسر في السلسلتين؟ ج: لم نُجرِ اختبارات على إصلاح كسر في السلسلتين. في هذه الحالة، إذا أُزيلت القاعدتان التالفتان في الوقت نفسه، فقد يحدث كسر في السلسلتين مما يؤدي إلى تفتت الحمض النووي. يصعب إصلاح الحمض النووي المتفتت بشدة. من ناحية أخرى، إذا كان أحد التفاعلين أسرع من الآخر، ولم يحدثا في الوقت نفسه، فمن المرجح أن يقوم مزيج إصلاح PreCR بإصلاحهما. س: ما هي أطوال الفجوات التي يمكن إصلاحها باستخدام مزيج إصلاح PreCR؟ ج: طول الفجوة الدقيق غير معروف. بناءً على خبرتنا، يتراوح بين 5 و10 نيوكليوتيدات. س: هل يعمل مزيج إصلاح PreCR مع كميات أقل تركيزًا من الحمض النووي (مثل 500 بيكوغرام - 1 نانوغرام) من الكميات الموصى بها؟ ج: تم اختبار مزيج الإصلاح مع كميات منخفضة من قالب الحمض النووي تصل إلى 100 بيكوغرام. في هذه الحالة، يحدث الإصلاح القائم على PreCR بنفس كفاءة حدوثه عند تركيزات الحمض النووي الأعلى المذكورة في بطاقة البيانات. تركيز قالب البداية الموصى به للإصلاح (50-500 نانوغرام) هو مجرد شرط تفاعل مقترح، ولا يمثل حدود تركيز الحمض النووي التي يمكن عندها إجراء الإصلاح بواسطة مزيج إصلاح PreCR. س: عند معالجة القوالب بالبيسلفيت، قد تُشكل تفاعلات PCR اللاحقة مشكلة لأن الحمض النووي يبدو غير مستقر للغاية بعد المعالجة. هل يمكن لمزيج إصلاح PreCR تحسين نتائج تفاعل PCR هذه؟ ج: يحتوي مزيجنا الحالي على UDG ولن يُصلح قوالب الحمض النووي المعالجة بالبيسلفيت. يُعدّ استبعاد إنزيم UDG فكرة جيدة، ولكن في تسلسل البيسلفيت، يجب أن يمر الحمض النووي بخطوة الحمض النووي أحادي السلسلة، ومزيج إصلاح PreCR الحالي لدينا لا يُصلح الحمض النووي أحادي السلسلة بشكل كافٍ. س: هل من الضروري تنظيف تفاعل PreCR قبل إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)؟ ج: لا. لا يوجد تركيز كافٍ من النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs) في مزيج إصلاح PreCR للتداخل مع تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. س: عند العمل مع القطع، هل سيتم ربط الأطراف معًا بواسطة مزيج تفاعل PreCR؟ ج: لا، إنزيم Taq DNA ligase الموجود في المزيج سيربط فقط عند وجود قطع في الحمض النووي ثنائي السلسلة (dsDNA). س: هل يمكن استخدام إنزيم T4 DNA ligase للربط عبر موقع خالٍ من القاعدة؟ ج: لن يربط إنزيم T4 DNA ligase عبر موقع AP. سيقوم مزيج إصلاح PreCR بإصلاح موقع AP (في الحمض النووي ثنائي السلسلة فقط)، وإضافة القاعدة المناسبة، ثم ربط بنية الحمض النووي ثنائي السلسلة معًا. س: كيف يتم إصلاح المواقع الخالية من القواعد بواسطة مزيج تفاعل PreCR؟ هل تُضاف نيوكليوتيدات جديدة وتُربط؟ هل يُصلح النيوكليوتيد الموجود؟ ج: تتعرف إنزيمات إصلاح الحمض النووي على الموقع الخالي من القواعد وتقطع هيكل الحمض النووي. يستبدل إنزيم البوليميراز القاعدة المفقودة بالقاعدة الصحيحة، ويربط إنزيم الليغاز الحمض النووي.