نيو إنجلاند بيولابس، M0315L، ناقل طرفي

يحفز إنزيم ناقل الطرفية إضافة ديوكسي نيوكليوتيدات إلى الطرف الهيدروكسيلي 3' لجزيئات الحمض النووي. التصنيفات ذات الصلة: وسم الحمض النووي، تطبيقات معالجة الحمض النووي، إضافة ذيل الأدينين، مواصفات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي تحفز دمج 1 نانومول من dTTP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر خلال ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية باستخدام d(A) 18 كبادئ. شروط التفاعل: عبوة واحدة من محلول تفاعل ناقل الطرفية، مضاف إليها 0.25 ملي مول من كلوريد الكوبالت، حضن عند 37 درجة مئوية. عبوة واحدة من محلول تفاعل ناقل الطرفية، 50 ملي مول من أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مول من أسيتات التريس، 10 ملي مول من أسيتات المغنيسيوم (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 50 ملي مول من فوسفات البوتاسيوم، 100 ملي مول من كلوريد الصوديوم، 1.43 ملي مول من بيتا-ميركابتوإيثانول، 50% جلسرين، 0.1% تريتون إكس-100، الأس الهيدروجيني 7.3 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري: 75 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. الوزن الجزيئي النظري: 58000 دالتون. إكسونوكلياز 5' - 3': لا. إكسونوكلياز 3' - 5': لا. إزاحة السلسلة : لا. شروط فحص الوحدة : عبوة واحدة من محلول تفاعل ناقل الطرفية، 0.72 μM d(A) 18، 0.2 ملي مولار dTTP، و1 ميكروكوري [3H]- dTTP في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. الأسئلة الشائعة : س: هل يمكن تعطيل إنزيم ناقل الطرفية بالحرارة؟ ج: نعم، سخّنه إلى 75 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بدلاً من ذلك، يمكن إيقاف التفاعلات بإضافة 10 ميكرولتر من EDTA بتركيز 0.2 مولار. س: هل يمكن لإنزيم ناقل الطرفية وسم الطرف 5' من الحمض النووي؟ ج: لا. استخدم إنزيم T4 بولينوكليوتيد كيناز (NEB# M0201) لوسم الطرف 5'. س: هل يُزوّد ​​إنزيم ناقل الطرفية مع dNTPs؟ ج: لا، يجب طلب dNTPs بشكل منفصل. يمكن طلبها كمجموعة من 4 أنابيب فردية، مجموعة محلول ديوكسي نيوكليوتيد (NEB# N0446) بتركيز 100 ملي مولار لكل نيوكليوتيد. س: هل يتطلب إنزيم ناقل الطرفية أيون الكوبالت (Co2+) كأيون ثنائي التكافؤ؟ ج: يزيد أيون الكوبالت (Co2+) من دمج البيريميدينات (مانياتيس)، ويجعل الإضافة إلى النهايات غير المتداخلة والنهايات المتراجعة 3' أكثر كفاءة (البروتوكولات الحالية). س: هل يمكن إضافة نيوكليوتيد واحد فقط (dNTP) إلى نهاية الحمض النووي باستخدام إنزيم ناقل الطرفية؟ ج: نعم، يمكن إضافة نيوكليوتيد واحد عن طريق دمج نظير إنهاء السلسلة مثل ثنائي ديوكسي نيوكليوتيد (ddATP). س: هل يفضل إنزيم ناقل الطرفية نوعًا معينًا من نهايات الحمض النووي 3'؟ ج: إضافة النيوكليوتيدات (dNTPs) إلى النهايات البارزة 3' OH أكثر كفاءة من إضافتها إلى النهايات المتراجعة 3' OH أو النهايات غير المتداخلة. س: ما هي قيم kM لإنزيم ناقل الطرفية؟ ج: * 100 ميكرومولار لـ dATP * 100 ميكرومولار لـ dTTP * 500 ميكرومولار لـ dCTP * 500 ميكرومولار لـ dGTP * 1 ميكرومولار للأوليغومرات * 1 مليمولار لنهايات البادئات المتجانسة. س: هل سيضيف إنزيم النقل الطرفي نيوكليوتيدًا ثلاثي الفوسفات غير موسوم إشعاعيًا؟ ج: نعم، سيدمج إنزيم النقل الطرفي النيوكليوتيدات المبيوتينية.