نيو إنجلاند بيولابس، M0317L، إنزيم ربط الحمض النووي T3

سيقوم إنزيم T3 DNA Ligase بربط هذه الركائز: الفئات ذات الصلة تطبيقات إنزيمات ربط الحمض النووي الاستنساخ مواصفات الربط تعريف الوحدة يتم تعريف الوحدة الواحدة على أنها كمية الإنزيم المطلوبة لإعطاء 50٪ ربط لـ 100 نانوغرام من قطع HindIII من الحمض النووي λ في حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر في دقيقة واحدة عند 25 درجة مئوية في محلول StickTogether DNA Ligase Buffer 1X. شروط التفاعل: محلول منظم StickTogether™ DNA Ligase بتركيز 1X، يُحضن عند درجة حرارة 25 درجة مئوية. محلول منظم StickTogether™ DNA Ligase بتركيز 1X: 66 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار MgCl2، 1 ملي مولار ATP، 1 ملي مولار DTT، 7.5% بولي إيثيلين جلايكول (PEG 6000) (الأس الهيدروجيني 7.6 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 50% جلسرين، 0.1 ملي مولار EDTA، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: لا. الأسئلة الشائعة : س: ما نوع نهايات الحمض النووي التي يمكن لإنزيم T3 DNA Ligase ربطها؟ ج: يمكن لإنزيم T3 DNA Ligase ربط النهايات المتماسكة والنهايات غير المتماسكة. س: هل يمكن استخدام إنزيم T3 DNA Ligase مع محلول منظم لا يحتوي على PEG؟ ج: نعم. نوصي باستخدام محلول منظم T4 DNA Ligase بتركيز 1X. يرجى ملاحظة أن النشاط النوعي لإنزيم T3 DNA Ligase في محلول منظم خالٍ من البولي إيثيلين جلايكول (PEG) يكون أقل بحوالي عشرة أضعاف. س: هل يتمتع إنزيم T3 DNA Ligase بتحمل أعلى للأملاح مقارنةً بإنزيم T4 DNA Ligase؟ ج: نعم. يتحمل إنزيم T3 DNA Ligase تركيزات ملحية تصل إلى 250-300 ملي مولار في التفاعل. يُرجى ملاحظة أنه في وجود البولي إيثيلين جلايكول (PEG)، سيترسب الحمض النووي في محلول ملحي عالي التركيز، مما يُعيق عملية الربط. إذا كنت ترغب في ربط الحمض النووي في وجود ملح بتركيز يزيد عن 100 ملي مولار، نوصي باستخدام محلول منظم T4 DNA Ligase بتركيز 1X. س: هل يمكن تعطيل إنزيم T3 DNA Ligase بالحرارة؟ ج: نعم، تسخين تفاعل يحتوي على إنزيم T3 DNA Ligase عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق سيؤدي إلى تعطيل الإنزيم. مع ذلك، يجب إجراء التفاعل في محلول منظم خالٍ من البولي إيثيلين جلايكول (PEG). لا تقم بتعطيل الإنزيم بالحرارة إذا كان محلول التفاعل المنظم يحتوي على البولي إيثيلين جلايكول (PEG)، لأن ذلك سيُعيق عملية التحويل. س: ما هي بعض المشاكل المحتملة في تفاعل الربط باستخدام إنزيم T3 DNA Ligase والتي قد تؤدي إلى فشل التحويل؟ ج: فشل الربط لعدم وجود ATP أو Mg2+. استخدم المحلول المنظم المرفق أو أضف ATP إلى محلول منظم متوافق. قد يكون ATP الموجود في المحاليل المنظمة التي يزيد عمرها عن عام قد تحلل بدرجة كافية للتسبب في مشاكل. عند إضافة ATP، تأكد من استخدام ريبوز ATP لأن ديوكسي ريبوز ATP لن يعمل. فشل الربط بسبب ارتفاع نسبة الملح أو EDTA في التفاعل. نظف الحمض النووي. لم يتم تعطيل CIP أو BAP أو SAP تمامًا من خطوة إزالة الفسفرة. اتبع الإجراء الموصى به لإزالة الفوسفاتاز. أنتج الربط حمضًا نوويًا خطيًا فقط لأن تركيز الحمض النووي كان مرتفعًا جدًا. حافظ على تركيز الحمض النووي الكلي بين 1-10 ميكروغرام/مل. لا يحتوي كل من الجزء المُدخل والبلازميد على فوسفات. ملاحظة: قد لا تحتوي البادئات على فوسفات مما يؤدي إلى مشاكل في ربط النهايات غير المتطابقة في النواقل المُعالجة بـ CIP. اطلب بادئات تحتوي على فوسفات أو عالج البادئات باستخدام الكيناز. أُضيفت كمية زائدة من خليط الربط إلى الخلايا. أضف ما بين 1-5 ميكرولتر إلى 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. كان الليغاز غير نشط. اختبره على لامدا هيند III أو ركيزة مناسبة أخرى. احتوى خليط الربط على بولي إيثيلين جلايكول (PEG) وتم تحضينه طوال الليل. يؤدي الربط المطول باستخدام PEG إلى انخفاض كفاءة التحويل. قد يكون هذا بسبب الإنتاج التدريجي لقطع خطية كبيرة من الحمض النووي DNA التي يمكن أن تثبط التحويل. لم يتم تنقية خليط الربط قبل التثقيب الكهربائي. يجب إزالة المحلول المنظم وإلا ستتولد شرارة من الملح. قم بغسل العينة بالترشيح الغشائي أو استخدم عمودًا دوارًا للتنقية. يمنع PEG الموجود في محلول مجموعة الربط السريع (NEB# M2200) حدوث الشرارة ولكنه يمنع أيضًا التثقيب الكهربائي. يجب إزالة PEG باستخدام عمود دوار. س: ما هي بعض المشاكل الأخرى التي يجب مراعاتها عند استكشاف مشكلة التحويل وإصلاحها؟ ج: الخلايا غير قابلة للحياة. قم بتشغيل عناصر التحكم المذكورة أدناه واحصل على خلايا جديدة إذا لزم الأمر. الخلايا غير مؤهلة. قم بتشغيل الضوابط المذكورة أدناه، واحصل على خلايا جديدة إذا لزم الأمر. لا يتحمل الإشريكية القولونية البروتين المُعاد تركيبه جيدًا. حاول دمجه مع بروتين ربط المالتوز باستخدام نظام pMAL (NEB# E8000S). جرب نظام تعبير آخر لا يتضمن الإشريكية القولونية. يحتوي الحمض النووي المربوط على تكرارات معكوسة ومتتالية يتم استبعادها بواسطة الإشريكية القولونية. قم بإزالة تسلسل التكرار إن أمكن. جرب نظام تعبير آخر لا يتضمن الإشريكية القولونية. تم أخذ الحمض النووي المُدخل من حيوان ثديي أو نبات، ويحتوي على سيتوزين مثيل يتم تحليله بواسطة العديد من سلالات الإشريكية القولونية. استخدم سلالة تفتقر إلى mcrA وmcrBC وmrr. التركيب كبير جدًا (>10000 زوج قاعدي) للتحويل إلى خلايا مؤهلة كيميائيًا. استخدم التحويل الكهربائي. س: ما المشاكل التي يمكن مواجهتها في الهضم التقييدي والتي قد تتسبب في فشل الربط باستخدام T3 DNA Ligase أو التحويل اللاحق؟ ج: لم يقم إنزيم التقييد بالقطع بكفاءة. إذا كنت تقوم بالقطع بالقرب من نهاية قطعة PCR، اترك ما لا يقل عن 6 قواعد بعد موقع التقييد. اختبر إنزيم التقييد على ركيزة تحكم. لم يتم تعطيل إنزيم التقييد بشكل كامل. قم بتنقية الحمض النووي باستخدام الفينول/الإيثانول إذا تعذر تعطيل الإنزيم بالحرارة. أدى النشاط النجمي الناتج عن هضم التقييد إلى قطع الناقل أو القطعة المُدخلة. افحص الحمض النووي على هلام. إذا ظهرت حزمة إضافية، قلل كمية الإنزيم أو وقت هضم التقييد. يحتوي الحمض النووي أو إنزيم التقييد على إكسونوكلياز أو فوسفاتاز أدى إلى تلف الأطراف. قم بتنقية الحمض النووي باستخدام الفينول/الإيثانول. راجع بيانات مراقبة جودة الإنزيم والملاحظات. إذا كانت مراقبة جودة الربط ضعيفة أو كان مستوى الإكسونوكلياز مرتفعًا، قلل كمية الإنزيم أو وقت الحضانة. *عملية PCR محمية ببراءات اختراع مملوكة لشركة Roche Molecular Systems, Inc. س: ما هي الضوابط التي يجب إجراؤها لاختبار الخلايا والحمض النووي عند استخدام T3 DNA Ligase؟ ج: ملاحظة: استخدم نفس تركيز الحمض النووي لكل عنصر تحكم، عادةً من 0.1 إلى 1.0 نانوغرام لكل عملية تحويل. تحويل الناقل غير المقطوع في الخلايا المؤهلة يتحقق من حيوية الخلية ويختبر مقاومة البلازميد للمضادات الحيوية. يُزرع على وسط غذائي ووسط غذائي مضاف إليه مضاد حيوي. يختبر الناقل الخطي الخلفية الناتجة عن البلازميد غير المقطوع. يجب أن تكون أقل من 1% من القيمة التي تم الحصول عليها في الخطوة 1. يختبر البلازميد المقطوع والمعاد ربطه نشاط الليغاز وسلامة نهايات الحمض النووي. يجب أن تكون قريبة من القيمة التي تم الحصول عليها في الخطوة 1. يختبر البلازميد المقطوع والمُفَسْفَت والمعاد ربطه الخلفية الناتجة عن المعالجة غير الكاملة بالفوسفاتاز. يجب أن تكون أقل من 1% من القيمة التي تم الحصول عليها في الخطوة 1. س: ما كمية الحمض النووي التي يجب استخدامها في عملية الربط باستخدام إنزيم T3 DNA Ligase؟ ج: لتعزيز تكوين الدوائر، وهو أمر مفيد في التحويل، يجب أن يكون التركيز الإجمالي للناقل + المُدخل بين 1-10 ميكروغرام/مل لتحقيق ربط فعال. تُعد النسب المولية للمُدخل إلى الناقل بين 2 و6 مثالية للإدخالات الفردية. تؤدي النسب الأقل من 2:1 إلى انخفاض كفاءة الربط. بينما تعزز النسب الأعلى من 6:1 إدخال عدة تسلسلات. إذا لم تكن متأكدًا من تركيز الحمض النووي، فقم بإجراء عمليات ربط متعددة بنسب متفاوتة. سؤال: هل يعمل إنزيم T3 DNA Ligase في محلول rCutSmart؟ جواب: يعمل إنزيم T3 DNA Ligase في محلول rCutSmart، مع إضافة ATP وPEG. لمعرفة نسبة نشاطه الوظيفي في rCutSmart، ونسبة نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي الأخرى في عملية الاستنساخ، راجع مخطط نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي في محلول rCutSmart®.