نيو إنجلاند بيولابس، M0318L، إنزيم ربط الحمض النووي T7

سيقوم إنزيم T7 DNA Ligase بربط هذه الركائز: الفئات ذات الصلة تطبيقات إنزيمات ربط الحمض النووي الاستنساخ مواصفات الربط تعريف الوحدة يتم تعريف الوحدة الواحدة على أنها كمية الإنزيم المطلوبة لإعطاء 50٪ ربط لـ 100 نانوغرام من قطع HindIII من الحمض النووي λ في حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر في 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية في محلول StickTogether DNA Ligase Buffer 1X. شروط التفاعل: محلول منظم لربط الحمض النووي StickTogether™ بتركيز 1X، يُحضن عند درجة حرارة 25 درجة مئوية. محلول منظم لربط الحمض النووي StickTogether™ بتركيز 1X: 66 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار MgCl2، 1 ملي مولار ATP، 1 ملي مولار DTT، 7.5% بولي إيثيلين جلايكول (PEG 6000) (الأس الهيدروجيني 7.6 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: لا. الأسئلة الشائعة : س: يُوصف إنزيم T7 DNA Ligase بأنه إنزيم يربط فقط قطع الحمض النووي ذات النهايات المتماسكة. ما هو طول النهاية المتماسكة التي يمكن لإنزيم T7 DNA Ligase ربطها؟ ج: يمكن لإنزيم T7 DNA Ligase ربط قطع الحمض النووي ذات النهايات المتماسكة التي يبلغ طولها 2 زوج قاعدي أو أكثر. إنزيم T7 DNA Ligase يربط الأطراف المتدلية ذات زوج قاعدي واحد بكفاءة منخفضة. كما أنه لا يربط قطع الحمض النووي ذات الأطراف غير المتدلية بفعالية، إلا في ظروف تفاعل ذات تركيزات عالية جدًا من البولي إيثيلين جلايكول (PEG) (20-30% وزن/حجم). س: هل يمكن استخدام إنزيم T7 DNA Ligase مع محلول منظم لا يحتوي على PEG؟ ج: نعم. نوصي باستخدام محلول منظم T4 DNA Ligase بتركيز 1X. يُرجى ملاحظة أن النشاط النوعي لإنزيم T7 DNA Ligase في محلول منظم لا يحتوي على PEG يكون أقل بحوالي 10 أضعاف. س: هل يمكن تعطيل إنزيم T7 DNA Ligase بالحرارة؟ ج: نعم، تسخين تفاعل يحتوي على إنزيم T7 DNA Ligase عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق سيؤدي إلى تعطيل الإنزيم. مع ذلك، يجب إجراء التفاعل في محلول منظم خالٍ من PEG. لا تقم بتعطيل الإنزيم بالحرارة إذا كان محلول التفاعل يحتوي على PEG، لأن ذلك سيمنع عملية التحويل. س: ما هي بعض المشاكل المحتملة في تفاعل الربط باستخدام إنزيم T7 DNA Ligase التي قد تؤدي إلى فشل عملية التحويل؟ أ: فشلت عملية الربط لعدم وجود ATP أو Mg2+. استخدم المحلول المنظم المرفق أو أضف ATP إلى محلول منظم متوافق. قد يكون ATP الموجود في المحاليل المنظمة التي يزيد عمرها عن عام قد تحلل بدرجة كافية للتسبب في مشاكل. عند إضافة ATP، تأكد من استخدام ريبوز ATP لأن ديوكسي ريبوز ATP لن يعمل. فشلت عملية الربط بسبب ارتفاع نسبة الملح أو EDTA في التفاعل. نظف الحمض النووي. لم يتم تعطيل CIP أو BAP أو SAP تمامًا من خطوة إزالة الفسفرة. اتبع الإجراء الموصى به لإزالة الفوسفاتاز. أنتجت عملية الربط حمضًا نوويًا خطيًا فقط لأن تركيز الحمض النووي كان مرتفعًا جدًا. حافظ على تركيز الحمض النووي الكلي بين 1-10 ميكروغرام/مل. لا يحتوي كل من الجزء المُدخل والبلازميد على فوسفات. ملاحظة: قد لا تحتوي البادئات على فوسفات مما يؤدي إلى مشاكل في ربط النهايات غير المتطابقة في النواقل المُعالجة بـ CIP. اطلب بادئات تحتوي على فوسفات أو عالج البادئات باستخدام الكيناز. تمت إضافة كمية كبيرة جدًا من خليط الربط إلى الخلايا. أضف ما بين 1-5 ميكرولتر إلى 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. كان الليغاز غير نشط. اختبر على لامدا هيند III أو ركيزة مناسبة أخرى. احتوى مزيج الربط على بولي إيثيلين جلايكول (PEG) وتم تحضينه طوال الليل. يؤدي الربط المطول باستخدام PEG إلى انخفاض كفاءة التحويل. قد يكون هذا بسبب الإنتاج التدريجي لقطع خطية كبيرة من الحمض النووي DNA التي يمكن أن تثبط التحويل. لم يتم تنقية مزيج الربط قبل التحويل الكهربائي. يجب إزالة المحلول المنظم وإلا ستتولد شرارة من الملح. قم بغسل العينة بالترشيح الغشائي أو استخدم عمودًا دوارًا للتنقية. يمنع PEG الموجود في محلول مجموعة الربط السريع (NEB# M2200) حدوث الشرارة ولكنه يمنع أيضًا التحويل الكهربائي. يجب إزالة PEG باستخدام عمود دوار. س: ما هي بعض المشاكل الأخرى التي يجب مراعاتها عند استكشاف مشكلة التحويل وإصلاحها؟ ج: الخلايا غير قابلة للحياة. قم بتشغيل عناصر التحكم المذكورة أدناه واحصل على خلايا جديدة إذا لزم الأمر. الخلايا غير مؤهلة. قم بتشغيل عناصر التحكم المذكورة أدناه واحصل على خلايا جديدة إذا لزم الأمر. لا تتحمل بكتيريا الإشريكية القولونية البروتين المُعاد تركيبه جيدًا. حاول دمجه مع بروتين ربط المالتوز باستخدام نظام pMAL (NEB# E8000S). جرب نظام تعبير آخر لا يتضمن الإشريكية القولونية. يحتوي الحمض النووي المربوط على تكرارات معكوسة ومتتالية يتم استبعادها بواسطة الإشريكية القولونية. أزل تسلسل التكرار إن أمكن. جرب نظام تعبير آخر لا يتضمن الإشريكية القولونية. تم أخذ الحمض النووي المُدخل من حيوان ثديي أو نبات ويحتوي على سيتوزين مثيل يتم تحليله بواسطة العديد من سلالات الإشريكية القولونية. استخدم سلالة تفتقر إلى mcrA وmcrBC وmrr. التركيب كبير جدًا (>10000 زوج قاعدي) للتحويل إلى خلايا مؤهلة كيميائيًا. استخدم التحويل الكهربائي. س: ما المشاكل التي يمكن مواجهتها في عملية الهضم بالإنزيمات المقيدة والتي قد تتسبب في فشل الربط باستخدام إنزيم T7 DNA Ligase أو التحويل اللاحق؟ ج: لم يقم إنزيم التقييد بالقطع بكفاءة. إذا كنت تقطع بالقرب من نهاية قطعة PCR، اترك 6 قواعد على الأقل بعد موقع التقييد. اختبر إنزيم التقييد على ركيزة تحكم. لم يتم تعطيل إنزيم التقييد تمامًا. نقّي الحمض النووي باستخدام الفينول/الإيثانول إذا تعذر تعطيل الإنزيم بالحرارة. أدى النشاط القوي الناتج عن هضم التقييد إلى قطع الناقل أو القطعة المُدخلة. افحص الحمض النووي على هلام. إذا ظهرت حزمة إضافية، قلل كمية الإنزيم أو وقت هضم التقييد. احتوى الحمض النووي أو إنزيم التقييد على إكسونوكلياز أو فوسفاتاز أدى إلى تلف الأطراف. نقّي الحمض النووي باستخدام الفينول/الإيثانول. راجع بيانات مراقبة جودة الإنزيم والملاحظات. إذا كانت جودة الربط ضعيفة أو كان مستوى الإكسونوكلياز مرتفعًا، قلل كمية الإنزيم أو وقت الحضانة. *عملية PCR محمية ببراءات اختراع مملوكة لشركة Roche Molecular Systems, Inc. س: ما كمية الحمض النووي التي يجب استخدامها في الربط باستخدام T7 DNA Ligase؟ ج: لتعزيز تكوين الدوائر، وهو أمر مفيد في عملية التحويل، يجب أن يتراوح التركيز الإجمالي للناقل + القطعة المُدخلة بين 1 و10 ميكروغرام/مل لضمان ربط فعال. تُعد النسب المولية للقطعة المُدخلة إلى الناقل بين 2 و6 مثالية للإدخالات الفردية. تؤدي النسب الأقل من 2:1 إلى انخفاض كفاءة الربط. بينما تُعزز النسب الأعلى من 6:1 إدخالات متعددة. إذا لم تكن متأكدًا من تركيزات الحمض النووي لديك، فقم بإجراء عمليات ربط متعددة بنسب متفاوتة. س: هل يعمل إنزيم T7 DNA Ligase في محلول rCutSmart؟ ج: يعمل إنزيم T7 DNA Ligase في محلول rCutSmart، مع إضافة ATP وPEG. لمعرفة النسبة المئوية لنشاطه الوظيفي في rCutSmart، ونشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي الأخرى في عملية الاستنساخ، راجع مخطط نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي في محلول rCutSmart®.