نيو إنجلاند بيولابس، M0319S، إنزيم ربط الحمض النووي DNA/RNA المقاوم للحرارة 5´ App

إنزيم ربط الحمض النووي/الرنا المقاوم للحرارة ذو الطرف 5' يربط رابط الحمض النووي المُسبق الأدينيل والمُحجوب عند الطرف 3' بمجموعة الهيدروكسيل 3' في الحمض النووي الريبي والحمض النووي أحادي السلسلة. الفئات ذات الصلة: ربط الحمض النووي الريبي، إنزيمات ربط الحمض النووي. التطبيقات: ربط غير مُستنسخ. المواصفات: شروط التفاعل: 1X NEBuffer™ 1، حضانة عند 65 درجة مئوية. 1X NEBuffer™ 1، 10 ملي مولار Bis-Tris-Propane-HCl، 10 ملي مولار MgCl2، 1 ملي مولار DTT (الأس الهيدروجيني 7 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 50 ملي مولار KCl، 10 ملي مولار Tris-HCl، 0.1 ملي مولار EDTA، 1 ملي مولار DTT، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري : لا. الأسئلة الشائعة : س: كيف يُمكن تصنيع رابط الحمض النووي المُؤدينيل؟ ج: إحدى الطرق الفعّالة هي استخدام مجموعة أدينيل الحمض النووي 5' (NEB# E2610) لتحويل الحمض النووي البلازميدي (pDNA) إلى الحمض النووي الريبوزي التطبيقي (AppDNA). س: هل يمكنني استخدام إنزيم ربط الحمض النووي الريبوزي Mth من النوع البري الموجود في مجموعة أدينيل الحمض النووي 5' بدلاً من إنزيم ربط الحمض النووي الريبوزي التطبيقي/الريبوزي 5' المقاوم للحرارة لبناء المكتبة؟ ج: لا. إنزيم Mth من النوع البري فعّال جدًا في الأدينيل، ولكنه غير فعّال في الربط. س: ما هي كمية إنزيم ربط الحمض النووي الريبوزي التطبيقي/الريبوزي 5' المقاوم للحرارة التي أحتاج إلى إضافتها إلى التفاعل؟ ج: إنزيم الربط عبارة عن ثنائي الوحدات وله معدل دوران منخفض جدًا، لذا أضف ما لا يقل عن ضعف التركيز المولي من الإنزيم إلى الركيزة. س: لماذا توصون بإضافة كلوريد المنغنيز (MnCl2) إلى ربط الحمض النووي ولكن ليس إلى تفاعل الحمض النووي الريبوزي؟ ج: لا يُضاف كلوريد المنغنيز إلى ربط الحمض النووي الريبوزي لتقليل التحلل الناتج عن المعدن للحمض النووي الريبوزي. س: هل يقوم إنزيم الربط الحراري المقاوم للحرارة 5' AppDNA/RNA ligase بربط الحمض النووي الريبوزي المزدوج (dsRNA) أو الحمض النووي الريبوزي المزدوج (dsDNA)؟ ج: لا، يستخدم الإنزيم ركائز أحادية السلسلة فقط. س: هل يؤدي استخدام البولي إيثيلين جلايكول (PEG) أو زيادة وقت الحضانة إلى زيادة كمية الناتج المربوط؟ ج: لا يُحسّن البولي إيثيلين جلايكول (PEG) عملية الربط. قد تزداد كمية الناتج المربوط عند زيادة وقت الحضانة. س: لماذا يظهر الحمض النووي الريبوزي (RNA) على شكل لطخة أو عالقًا في البئر؟ ج: يرتبط الإنزيم بقوة بالحمض النووي الريبوزي (RNA)، مما قد يؤدي إلى ظهوره على شكل لطخة أو عالقًا في البئر. التسخين عند 90 درجة مئوية لمدة 3 دقائق أو المعالجة ببروتينيز K يُحرر الحمض النووي الريبوزي (RNA)؛ في بعض العينات، تكون المعالجة ببروتينيز K ضرورية. س: ما مدى تحمل هذا الإنزيم للملح؟ أ: NEB # RNA Ligase Salt Tolevance M0204 T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) ≤ 50 mM M0239 T4 RNA Ligase 2 (dsRNA Ligase) ≤ 50 mM M0242 T4 RNA Ligase 2, truncated ≤ 100 mM M0351 T4 RNA Ligase 2, trunc. K277Q ≤ 100 mM M0373 T4 RNA Ligase 2, trunc. KQ ≤ 100 mM M0375 SplintR Ligase ≤ 50 mM E2610 5' Adenylation Kit (Mth Ligase) ≤ 300 mM M0319 Thermostable 5' App DNA/RNA Ligase ≤ 50 mM