نيو إنجلاند بيولابس، M0328S، بوليميراز الحمض النووي Bst، كامل الطول

الأداء الأمثل في عدد من التطبيقات الفئات ذات الصلة تطبيقات التضخيم متساوي الحرارة وإزاحة السلسلة مواصفات التضخيم متساوي الحرارة تعريف الوحدة تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي ستدمج 10 نانومول من dNTP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض في 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل ThermoPol® بتركيز 1X، يُحضن عند 65 درجة مئوية. محلول تفاعل ThermoPol® بتركيز 1X: 20 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار (NH4)2SO4، 10 ملي مولار KCl، 2 ملي مولار MgSO4، 0.1% Triton® X-100 (الأس الهيدروجيني 8.8 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، 0.1% Triton® X-100، الأس الهيدروجيني 7.1 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري: 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. إكسونوكلياز 5' - 3': نعم. إكسونوكلياز 3' - 5': لا. إزاحة السلسلة : لا. شروط فحص الوحدة: 50 ملي مولار KCl، 20 ملي مولار Tris-HCl (الأس الهيدروجيني 8.8)، 10 ملي مولار mM MgCl₂، 30 نانومول من M13mp18 SS DNA، 70 نانومول من بادئ تسلسل M13 (–47) 24-mer، 200 ميكرومول من dATP، 200 ميكرومول من dCTP، 200 ميكرومول من dGTP، 100 ميكرومول من dTTP بما في ذلك [³H]-dTTP و100 ميكروغرام/مل من BSA. الأسئلة الشائعة : س: ما هي بوليميرازات Hot Start وWarmStart® ومتى أستخدمها؟ ج: عند تحضير تفاعلات درجة حرارة الغرفة بعيدًا عن الجليد، وعند ملاحظة تضخيم غير نوعي. ماذا تعني Hot Start/Warm Start؟ تستخدم بوليميرازات Hot Start وWarmStart® الخاصة بنا أبتاميرات تثبط نشاط الإنزيم في درجة حرارة الغرفة، مما يمنع تكوين منتجات غير نوعية. لا يؤثر وجود هذه الأبتاميرات على وظيفة الإنزيم الأساسية. الفرق بين تقنية البدء الساخن وتقنية البدء الدافئ هو أن إنزيمات البدء الساخن محبة للحرارة، بينما إنزيمات البدء الدافئ محبة للحرارة المعتدلة؛ ويتشابه النطاق الديناميكي الحراري للأبتاميرات المستخدمة في كلتا التقنيتين إلى حد كبير. الأبتاميرات عبارة عن نيوكليوتيدات قليلة مصممة هندسيًا ترتبط بجزيء هدف محدد من خلال تفاعلات غير تساهمية، وتتضمن تعديلات محددة على قواعد النيوكليوتيدات لتحسين خصائص التثبيط و/أو تقليل الآثار الجانبية غير المقصودة. تتمثل ميزة التثبيط القائم على الأبتاميرات مقارنةً بتقنيات البدء الساخن الأخرى (مثل الأجسام المضادة) في أنها لا تتطلب خطوة تنشيط، وترتبط بشكل عكسي بطريقة تعتمد على درجة الحرارة. توفر شركة NEB بوليميرازات مزودة بأبتاميرات لتفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني، وتفاعل البوليميراز المتسلسل عالي الدقة، والتضخيم متساوي الحرارة، والنسخ العكسي. يمكن لهذه الأبتاميرات استهداف وظائف إنزيمية مختلفة لبوليميرازات مختلفة. للمزيد من المعلومات، لماذا تُسمى هذه التقنية "البدء الساخن"؟ على غرار العديد من بوليميرازات الحمض النووي من عائلة A غير المُدققة، يمتلك بوليميراز Taq القدرة على إضافة قواعد إلى نهاية الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) بطريقة مستقلة عن القالب حتى في درجة حرارة الغرفة، مما قد يؤدي إلى إضافة قواعد غير محددة إلى نهايات بادئات الحمض النووي في التفاعل، مما يسمح بالتهجين خارج الهدف ويقلل من خصوصية التفاعل الإجمالية. في المقابل، عند درجات حرارة أعلى، يقل الارتباط غير المحدد مع ازدياد صرامة عملية التلدين. ركزت الطرق المبكرة للتخفيف من النشاط غير المرغوب فيه عند درجات الحرارة المنخفضة على استبعاد مكونات التفاعل الرئيسية حتى يتم رفع درجة حرارة التفاعل، والتي يمكن إضافتها بعد ذلك إلى الخليط، مما يؤدي إلى بدء التفاعل في ظل ظروف أكثر تقييدًا ودرجة حرارة عالية. اقرأ مقالنا المميز، "استخدام الأبتاميرات للتحكم في أنشطة الإنزيم: بدء تشغيل Taq الساخن وما بعده"، للاطلاع على بيانات تقارن تكوين المنتج للإنزيمات مع وبدون تثبيط النشاط القائم على الأبتاميرات.