نيو إنجلاند بيولابس، M0332L، هيمو كلينتاك®

إلغاء استخلاص وتنقية الحمض النووي. الفئات ذات الصلة: بوليميرازات تفاعل البوليميراز المتسلسل الأخرى. التطبيقات: تفاعل البوليميراز المتسلسل بدون استخلاص، تفاعل البوليميراز المتسلسل المتخصص، مواصفات تفاعل البوليميراز المتسلسل. شروط التفاعل : عبوة محلول التفاعل Hemo KlenTaq® بتركيز 1X، محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 0.5% Tween® 20، 0.5% IGEPAL® CA-630، 50% جلسرين، درجة الحموضة 7.4 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: لا يوجد. إكسونوكلياز 5' - 3': لا يوجد. إكسونوكلياز 3' - 5': لا يوجد . شروط فحص الوحدة: محلول التفاعل ThermoPol® بتركيز 1X، 200 ميكرومولار من dNTPs بما في ذلك [3H]-dTTP و15 نانومولار من الحمض النووي M13 المُهيأ. الأسئلة الشائعة : س: ما هي نهايات منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل؟ أ: منتجات البوليميراز التطبيقية، نهايات منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، بوليميرازات Q5® عالية الدقة، بوليميرازات Phusion® ذات نهايات غير حادة، بوليميرازات OneTaq® ذات نهايات غير حادة لتفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني والمتخصص، بوليميرازات Taq® ذات نهايات غير حادة، بوليميرازات LongAmp® ذات نهايات غير حادة، بوليميراز Hemo KlenTaq ذو نهايات غير حادة، بوليميرازات Bst ذات نهايات غير حادة، بوليميراز Bsu ذو نهايات غير حادة، بوليميراز phi29 ذو نهايات غير حادة، معالجة الحمض النووي، بوليميراز T7 DNA ذو نهايات غير حادة، بوليميراز E. coli DNA I ذو نهايات غير حادة، بوليميراز DNA I، جزء كبير (Klenow) ذو نهايات غير حادة، جزء Klenow ذو نهايات غير حادة (3′-5′ خارجي-) ذو نهايات غير حادة، بوليميراز T4 DNA ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Vent® ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Vent® (خارجي-) ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Deep Vent® ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Deep Vent® (خارجي-) ذو نهايات غير حادة للحصول على مزيد من التفاصيل حول بوليميرازاتنا، بما في ذلك أنشطة الإكسونوكلياز وتطبيقاتها، يُرجى زيارة مخطط اختيار بوليميراز الحمض النووي. للمزيد من المعلومات حول نشاط الإكسونوكلياز، يُرجى الاطلاع على الأسئلة الشائعة. لماذا تُزيل بعض البوليميرازات النهايات غير المتداخلة بينما تُضيف أخرى نيوكليوتيدًا؟ تُضيف البوليميرازات التي تمتلك نشاط التدقيق (إكسونوكلياز 3'-5')، مثل Q5 وPhusion وDeep Vent، نيوكليوتيدًا غير مُنسوخ إلى نهايات 3' لقطع الحمض النووي الممتدة، ولكن نشاط الإكسونوكلياز يُزيله لاحقًا. أما البوليميرازات الأخرى التي تفتقر إلى نشاط الإكسونوكلياز 3'-5' (مثل Taq والبوليميرازات القائمة على Taq) فتُضيف نيوكليوتيدًا إضافيًا إلى نهايات 3' (غالبًا، ولكن ليس حصريًا، dA) وتترك الجزء غير المُنسوخ سليمًا. لهذا السبب، من المهم معرفة البوليميراز المناسب عند إجراء استنساخ النهايات غير المتداخلة أو استنساخ T/A. إن بوليميرازات الحمض النووي OneTaq وLongAmp Taq عبارة عن مزيج مُحسَّن من بوليميرازات الحمض النووي Taq (بوليميراز من العائلة A) وDeep Vent (بوليميراز من العائلة B). يُضيف نشاط البوليميراز الذاتي لـ Taq تسلسل 3'A غير مُستنسخ، بينما يزيد نشاط الإكسونوكلياز 3'–5' لـ Deep Vent من دقة وقوة Taq، ولكنه يُقلل أيضًا من وضوح نهايات الحمض النووي الناتجة عن تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). لهذا السبب، تُنتج هذه النهايات خليطًا من نهايات الحمض النووي. مع ذلك، فإن غالبية النهايات ستكون ذات امتداد 3'A. س: كيف يُمكنني تحديد درجة حرارة التلدين المناسبة لتفاعلي؟ ج: يُمكن تحديد درجة حرارة التلدين المثلى (Ta) لزوج البادئات تجريبيًا عن طريق إجراء تفاعل PCR متدرج. يُرجى استخدام حاسبة Tm من NEB لتحديد درجة حرارة التلدين الأولية لزوج البادئات وبوليميراز/محلول NEB المُستخدم. على عكس الآلات الحاسبة الأخرى، تأخذ حاسبة NEB Tm في الاعتبار مكونات المحلول المنظم التي تؤثر على درجات حرارة الانصهار والملاحظات التجريبية عند حساب درجة حرارة التلدين المثلى. قد تقلل الآلات الحاسبة الأخرى عبر الإنترنت من تقدير أفضل درجة حرارة تلدين لبوليميراز Q5. لمزيد من المعلومات حول استخدام درجة حرارة تلدين واحدة (أي "عالمية")، يرجى الاطلاع على مذكرتنا التطبيقية: درجة حرارة التلدين العالمية في تفاعل البوليميراز المتسلسل وتأثيرها على نتائج التضخيم. يُعد تفاعل البوليميراز المتسلسل الفعال عملية توازن ديناميكية بين المواد الكيميائية والمتفاعلات التي تعزز التفاعل المحدد للبادئ مع مكمله في القالب عند درجة حرارة التلدين المختارة. في حين أن درجات حرارة التلدين هي قيم ثابتة يختارها العالم، إلا أن درجات حرارة الانصهار بين كل بادئ والقالب يمكن أن تختلف من منتج تضخيم إلى آخر. ملاحظة: يناقش هذا القسم تحديدًا تلدين بادئ قليل النوكليوتيدات مع قالب الحمض النووي. خلال مرحلة التمسخ في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، تعمل درجة الحرارة العالية على فصل الحمض النووي المزدوج (dsDNA) إلى حمض نووي أحادي السلسلة (ssDNA)، كاشفةً عن تسلسلات نيوكليوتيدية معقدة تسمح بتكوين رابطة (ارتباط، تهجين، اقتران) بادئ أوليغونوكليوتيدي مكمل أحادي السلسلة عند درجة حرارة منخفضة. تُعرف درجة حرارة التمسخ (TA) بأنها درجة الحرارة المستخدمة خلال مرحلة تمسخ البادئ في تفاعل البلمرة المتسلسل، وتعتمد على درجة انصهار البادئ. درجة انصهار البادئ (TM) هي درجة الحرارة التي يرتبط عندها 50% من البادئ بجزيء الحمض النووي المكمل له، بينما يبقى 50% منه حرًا في المحلول نتيجة انفصاله ("انصهاره") عن جزيء الحمض النووي المكمل له. لماذا يُعد استخدام درجة حرارة التمسخ الصحيحة أمرًا بالغ الأهمية لنجاح تفاعل البلمرة المتسلسل؟ عادةً ما تكون درجة حرارة التمسخ أقل من درجة انصهار البادئ لضمان تهجينه مع الحمض النووي المكمل. إذا كانت درجة حرارة التمسخ مرتفعة جدًا، فلن يرتبط البادئ بالحمض النووي المكمل ولن تتم عملية التضخيم. إذا كانت درجة حرارة التلدين منخفضة جدًا، فقد يحدث ارتباط غير نوعي بين البادئات والقالب أو بعضها البعض (ثنائيات البادئات)، مما يؤدي إلى: زيادة احتمالية تكوين نواتج غير نوعية، وانخفاض تكوين الناتج المطلوب بسبب ظروف التفاعل غير الفعالة. تؤثر متفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على درجة انصهار البادئات ودرجة حرارة تلدين التفاعل. لا تُعد درجات الانصهار قيمًا ثابتة في تفاعل PCR، بل تتأثر بعدة عوامل، منها: طول البادئ ونسبة الجوانين والسيتوزين إلى الأدينين والثايمين (نسبة محتوى GC). يُحدد طول البادئ كمية الروابط الهيدروجينية بين البادئ ومكمله. كلما زادت الروابط الهيدروجينية (ارتفاع درجة الانصهار) بين البادئ والقالب، زادت الطاقة اللازمة لكسر هذه الروابط (ارتفاع درجة الحرارة). تركيز البادئات: تُحدد درجة انصهار البادئات في تفاعل PCR بواسطة نوع الحمض النووي الموجود بوفرة مولية، والذي يجب أن يكون البادئات. المغنيسيوم والنيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs): يحدد تركيز أيونات المغنيسيوم الحرة [Mg2+] درجة انصهار الحمض النووي المزدوج، ولكن يمكن للمغنيسيوم أن يُحتجز بواسطة متفاعلات ونواتج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). ترتبط الشحنة الموجبة للمغنيسيوم بالفوسفات سالبة الشحنة في النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs) والبادئات والحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA). يؤدي تقليل التنافر الكهروستاتيكي (بين البادئات وفوسفات الحمض النووي أحادي السلسلة) إلى زيادة تركيز الكاتيونات أحادية التكافؤ (Na+، K+). تدعم الكاتيونات أحادية التكافؤ استقرار الحمض النووي المزدوج، على غرار أيونات المغنيسيوم. تتنافس الكاتيونات أحادية التكافؤ وأيونات المغنيسيوم على الارتباط بالحمض النووي. يؤدي زيادة تركيز الكاتيونات أحادية التكافؤ إلى تقليل ارتباط المغنيسيوم بالحمض النووي. س: نتائجي ليست كما هو متوقع. أين يمكنني العثور على مساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها؟ ج: تضخيم غير محدد، أو عدم حدوث تضخيم، أو حجم ناتج خاطئ. هل لديك نتيجة غريبة؟ راجع دليل استكشاف أخطاء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) وإصلاحها بعد تفاعلك لتحديد الأسباب المحتملة للنتائج غير المتوقعة والحلول. يمكنكم الاطلاع على المزيد من التفاصيل حول ظروف التفاعل وتحسين الإعداد في إرشاداتنا لتحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بوليميرازات الحمض النووي المحبة للحرارة، وفي هذه المدونة. يسعد فريق الدعم الفني دائمًا بمساعدتكم في حل أي مشاكل قد تواجهونها في تفاعل البوليميراز المتسلسل. إذا كنت ترغب في الحصول على مساعدة، يمكنك: مراسلتنا عبر البريد الإلكتروني على info@neb.com، أو الاتصال بالدعم الفني على الرقم (800)-0632-7799، متاح من الاثنين إلى الجمعة، من الساعة 9:00 صباحًا حتى 6:00 مساءً بتوقيت شرق الولايات المتحدة، أو ملء هذا النموذج الإلكتروني. فشل تضخيم هدف أكبر من 5 كيلوبايت: إذا كنت تواجه صعوبة في تضخيم هدف أكبر من 5 كيلوبايت، فجرب بعض هذه النصائح: نوصي باستخدام بوليميراز Q5® أو Phusion® أو LongAmp®. إذا كنت تستخدم Q5، فحاول تقليل تركيز البادئ النهائي إلى 150-300 نانومتر. تتيح تركيبات الإنزيم والمحلول المنظم المستقلة مرونة أكبر في تحسين التفاعل مقارنةً بالخلطات الرئيسية. استخدم المزيد من القالب. تعامل مع القالب المنقى برفق حتى لا يتلف. حسّن تركيز الإنزيم عن طريق اختبار معايرة الإنزيم في التفاعل (0.25-2 وحدة/50 ميكرولتر من التفاعلات). زد عدد الدورات. أطل وقت التمديد إلى 40 ثانية/كيلوبايت. التلطيخ على هلام الأغاروز: عند عدم توفر الظروف المثلى لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، غالبًا ما تُلاحظ لطخة أو مستوى عالٍ من الخلفية. جرّب واحدًا أو أكثر من الاقتراحات التالية: استخدم كمية أقل من الإنزيم. خفّض درجة حرارة التمديد بمقدار 3 درجات مئوية عن درجة حرارة التمديد الموصى بها في بروتوكول المنتج المحدد. على سبيل المثال، يوصي بروتوكول OneTaq® بدرجة حرارة تمديد 68 درجة مئوية؛ جرّب 65 درجة مئوية. ارفع درجة حرارة التلدين. جرّب بروتوكولات دورات ثنائية الخطوات. إذا ظهرت هالة مضيئة حول البئر بالإضافة إلى اللطخة من البئر، فاستخدم كمية أقل من القالب.