نيو إنجلاند بيولابس، M0337S، بوليميراز بولي (يو)

يحفز إنزيم بوليميراز بولي (يو) إضافة جزيء UMP من UTP أو AMP من ATP إلى الطرف 3' من الحمض النووي الريبي (RNA) دون الحاجة إلى قالب. الفئات ذات الصلة: تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) وإنزيمات النسخ العكسي، تخليق الحمض النووي الريبي (RNA)، النسخ في المختبر (IVT)، محاليل النيوكليوتيدات لتطبيقات الحمض النووي الريبي (RNA)، مواصفات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي تُدمج 1 نانومول من UMP في الحمض النووي الريبي (RNA) في حجم 50 ميكرولتر خلال 10 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول NEBuffer™ 2 بتركيز 1X، مُضاف إليه 0.5 ملي مول من UTP، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول التخزين: NEBuffer™ 2 بتركيز 1X، 50 ملي مول من كلوريد الصوديوم، 10 ملي مول من Tris-HCl، 10 ملي مول من كلوريد المغنيسيوم، 1 ملي مول من DTT (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 ملي مول من Tris-HCl، 100 ملي مول من كلوريد الصوديوم، 1 ملي مول من DTT، 0.1 ملي مول من EDTA، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. شروط فحص الوحدة : يُخلط محلول NEBuffer™ 2 بتركيز 1X، و0.5 ملي مول من 3H UTP، و5 ميكروغرام من حمض RNA الخميري في حجم تفاعل 50 ميكرولتر، ويُحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الأسئلة الشائعة : س: ما هو الوزن الجزيئي لإنزيم بوليميراز بولي (U)؟ ج: يبلغ الوزن الجزيئي لإنزيم بوليميراز بولي(U) 46 كيلو دالتون. س: ما نوع الـUTPs الموسومة التي يدمجها إنزيم بوليميراز بولي(U)؟ ج: يدمج إنزيم بوليميراز بولي(U) النيوكليوتيدات المشعة. لم يتم اختبار النيوكليوتيدات الموسومة بالبيوتين أو الفلوروفور. ومع ذلك، نتوقع أنه سيدمج علامات أخرى، وإن كان بمعدل أقل. س: هل يدمج إنزيم بوليميراز بولي(U) جزيئات GTP على الطرف 3' من الحمض النووي الريبي (RNA)؟ ج: يستطيع إنزيم بوليميراز بولي(U) إضافة عدد محدود (من 5 إلى 20) من نيوكليوتيدات الجوانين (G) إلى الطرف 3' من الحمض النووي الريبي (RNA). يختلف طول إضافة بولي G باختلاف ركائز الحمض النووي الريبي (RNA). في المقابل، يتميز إنزيم بوليميراز بولي(A) بانتقائية أعلى بكثير، حيث يُظهر تفضيلًا قويًا لـATP مقارنةً بـrGTP أو rCTP أو UTP. نادرًا ما تتم إضافة أي نيوكليوتيدات G باستخدام إنزيم بوليميراز بولي(A). س: ما هو طول ذيل البولي (U) المتوقع دمجه بواسطة بوليميراز البولي (U)؟ ج: في التفاعل القياسي الموصى به، يعتمد طول الذيل لبوليميراز البولي (U) على كلٍ من البادئ المتاح وتركيز اليوريدين ثلاثي الفوسفات (UTP). باستخدام بادئ يمتد بنسبة 100% من العينة، فإن حضانة نموذجية لمدة 30 دقيقة مع 0.5 ملي مولار من اليوريدين ثلاثي الفوسفات (UTP) ستؤدي إلى تمديد جميع جزيئات الحمض النووي الريبي (RNA) بحوالي 1000 قاعدة. س: هل يستطيع بوليميراز البولي (U) دمج جزيئات الجوانين ثلاثي الفوسفات (GTP) على الحمض النووي الريبي (RNA) الذي يحتوي على مجموعات معدلة كيميائيًا أو مجموعات 2-O-ميثيل في نهايته 3'؟ ج: نعم. ومع ذلك، فإن بوليميراز البولي (U) لديه تحيز قوي للبادئ بناءً على النيوكليوتيدات القليلة الأخيرة في النهاية 3'، لذلك في مجموعة مختلطة من الحمض النووي الريبي (RNA) حيث قد يحتوي بعض الحمض النووي الريبي (RNA) على تعديلات مثل كونه مزدوج السلسلة أو معدلًا كيميائيًا بمجموعات 2-O-ميثيل، قد تكون هناك حاجة إلى حضانة أطول للتفاعل. س: كيف يمكن تعطيل بوليميراز البولي (U) دون تسخين التفاعل؟ ج: يمكن تعطيل بوليميراز بولي (U) بإضافة EDTA إلى تركيز نهائي يبلغ 20 ملي مولار أو أعلى. ويمكن تنقية الحمض النووي الريبي ذي الذيل باستخدام استخلاص الفينول-الكلوروفورم أو باستخدام إجراءات تعتمد على الأعمدة. س: هل يعمل بوليميراز بولي (U) الخاص ببكتيريا الإشريكية القولونية في محلول النسخ العكسي M-MuLV؟ ج: نعم. محلول النسخ العكسي متوافق مع بوليميراز بولي (U). س: هل يمكن استخدام بوليميراز بولي (U) لإضافة ذيل بولي (U) إلى الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA)؟ ج: لا. يتطلب بوليميراز بولي (U) بادئًا للحمض النووي الريبي (RNA).