مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، M0345S، إكسونوكلياز V (RecBCD)

الفئات ذات الصلة: الإكسونوكليازات والإندونيوكليازات غير المحددة. تعريف الوحدة: تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لإنتاج 1 نانومول من ديوكسي ريبونوكليوتيد قابل للذوبان في الأحماض من الحمض النووي المزدوج في 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول NEBuffer™ 4 بتركيز 1X، مُضاف إليه 1 ملي مول من ATP، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول NEBuffer™ 4 بتركيز 1X، 50 ملي مول من أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مول من أسيتات التريس، 10 ملي مول من أسيتات المغنيسيوم، 1 ملي مول من DTT (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 50 ملي مول من Tris-HCl، 100 ملي مول من كلوريد الصوديوم، 1 ملي مول من DTT، 0.1 ملي مول من EDTA، 50% جلسرين، 0.1% Triton® X-100، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. شروط فحص الوحدة : محلول NEBuffer™ 4 بتركيز 1X، 1 ملي مول من ATP مع 0.15 ملي مول من الحمض النووي المزدوج [3H] المُعالج بالموجات فوق الصوتية. الأسئلة الشائعة : س: ما هو أفضل حجم للتفاعل لإزالة الحمض النووي المزدوج الخطي؟ أ: نوصي بحضانة تفاعل حجمه 30 ميكرولتر يحتوي على 10 وحدات من إنزيم إكسونوكلياز V لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لإزالة 1 ميكروغرام من الحمض النووي الخطي ثنائي السلسلة الذي يتراوح طوله بين 100 و1500 زوج قاعدي. ويمكن تقدير كمية الحمض النووي الخطي الموجود باستخدام الرحلان الكهربائي على هلام الأغاروز أو قياس النانودروب. يمكن تنقية الحمض النووي المعالج بشكل إضافي عن طريق الترسيب بالإيثانول أو الأعمدة الدوارة (مثل مجموعة Monarch PCR & DNA Cleanup Kit (NEB T1030)). إعداد التفاعل الموصى به (لإزالة أقل من 1 ميكروغرام/ميكرولتر من الحمض النووي): dsDNA x ميكرولتر، 10 × NEBuffer 4، 3 ميكرولتر، 10 ملي مولار ATP، 3 ميكرولتر، H2O، 23-x ميكرولتر، Exonuclease V، 1 ميكرولتر، المجموع 30 ميكرولتر. س: هل يؤثر اختلاف طرق تنقية الحمض النووي الجينومي المعزول على معدل انقسام Exonuclease V؟ ج: نعم. يتطلب Exonuclease V وجود نهايات حرة من الحمض النووي أحادي/ثنائي السلسلة ليعمل عليها. يُهضم الحمض النووي الجينومي المعزول من عمود دوار بسهولة أكبر مقارنةً بالحمض النووي الملفوف على قضيب زجاجي. بشكل عام، تكفي 5 وحدات من Exonuclease V لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي الجينومي (خلية HeLa) الذي تم يُنقى باستخدام عمود طرد مركزي، ويمكن استخدام 20 وحدة من إنزيم إكسونوكلياز V لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي الجينومي لبكتيريا الإشريكية القولونية الملفوف على قضيب زجاجي. س: هل يجب إضافة المزيد من الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) مع إنزيم إكسونوكلياز V عند زيادة حجم التفاعل؟ ج: نعم. يتطلب إنزيم إكسونوكلياز V الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) لقطع الحمض النووي أحادي/ثنائي السلسلة. مع ذلك، قد يؤدي تركيز الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) الذي يزيد عن 1 ملي مولار إلى تثبيط التفاعل. إذا كانت هناك حاجة لإزالة أكثر من 1 ميكروغرام من الحمض النووي، فيجب زيادة جميع المكونات بشكل متناسب، وحضانة التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. س: هل يعمل إنزيم إكسونوكلياز V (RecBCD) في محاليل NEBuffers الأخرى؟ ج: نعم. يتمتع إنزيم إكسونوكلياز V بنشاط مماثل في محاليل NEBuffers 2 و3 و4 (طالما تمت إضافة 1 ملي مولار من الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)). تبلغ فعاليته 50% في محلول NEBuffers 1. كما تبلغ فعاليته حوالي 75% في محلول تفاعل إنزيم ربط الحمض النووي T4 مع لا حاجة لإضافة ATP. نوصي بإضافة 1 ملي مول من ATP إلى التفاعل عند استخدام إكسونوكلياز V مباشرةً في تفاعل الربط. س: ما هو أفضل إكسونوكلياز لإزالة الحمض النووي الصبغي أثناء تحضير البلازميد؟ ج: يزيل إكسونوكلياز V (RecBCD) الحمض النووي الصبغي المتبقي بعد تنقية البلازميد. س: ما الإنزيم الذي يميز بين الحمض النووي للميتوكوندريا والحمض النووي الجينومي ويزيل الحمض النووي الجينومي فقط؟ ج: يُحلل إكسونوكلياز V (RecBCD) الحمض النووي أحادي السلسلة الخطي والحمض النووي ثنائي السلسلة مع الحفاظ على الحمض النووي البلازميدي المقطوع والملتف. س: هل يمكن استخدام إكسونوكلياز I مع إكسونوكلياز ثنائي السلسلة لتنظيف مستحضرات البلازميد؟ ج: يمكن استخدام إكسونوكلياز I مع لامدا إكسونوكلياز (NEB# M0262) لتنظيف مستحضرات البلازميد. إكسونوكلياز III (NEB# يعمل كل من إنزيم إكسونوكلياز M0206 (NEB# M0263) وإنزيم إكسونوكلياز T7 (NEB# M0263) أيضًا، ولكنهما يُتلفان البلازميدات المُقطّعة. على الرغم من إمكانية استخدام إنزيم إكسونوكلياز I، إلا أننا نوصي باستخدام إنزيم إكسونوكلياز V (RecBCD) (NEB #M0345) لإزالة الحمض النووي الصبغي بعد تحضير البلازميد (راجع ملاحظة التطبيق الخاصة بنا: استخدام إنزيم إكسونوكلياز V (RecBCD) للتخلص من الحمض النووي الجينومي المتبقي عند تنقية البلازميدات منخفضة النسخ باستخدام مجموعة Monarch® Plasmid Miniprep Kit). سؤال: هل لدى NEB بديل لإنزيم Plasmid-Safe من Lucigen؟ جواب: إنزيم إكسونوكلياز V يُعادل إنزيم Plasmid-Safe وظيفيًا، ويمكن استخدامه لإزالة الحمض النووي الصبغي المُلوِّث من تحضيرات البلازميد للحفاظ على الحمض النووي الدائري ثنائي السلسلة.