نيو إنجلاند بيولابس، M0351S، T4 RNA Ligase 2، مُقَطَّع K227Q

إنزيم T4 RNA Ligase 2، المُختزل K227Q، يربط الطرف 5' المُسبق الأدينيل من الحمض النووي DNA أو RNA بالطرف 3' من RNA. التصنيفات ذات الصلة : تطبيقات ربط RNA، استنساخ RNA. تعريف الوحدة: 200 وحدة هي كمية الإنزيم اللازمة لتحقيق ربط بنسبة 80% لـ RNA مكون من 31 نيوكليوتيدًا بالطرف المُسبق الأدينيل من DNA مكون من 17 نيوكليوتيدًا باستخدام رابط استنساخ miRNA العالمي (NEB #S1315) في حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر خلال ساعة واحدة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية. 5´-FAM- rArGrUrCrGrUrArGrCrCrUrUrUrArUrCrCrGrArGrArUrUrCrArGrCrArArUrA-3´ 5´-rAppCTGTAGGCACCATCAAT–NH 2 -3´ المولارية: 14 ميكرومولار التركيز: 200,000 وحدة/مل شروط التفاعل : محلول تفاعل T4 RNA Ligase بتركيز 1X، يُحضن عند 25 درجة مئوية. محلول تفاعل T4 RNA Ligase بتركيز 1X: 50 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار MgCl2، 1 ملي مولار DTT (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار NaCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية، يُسخن تعطيل عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. الوزن الجزيئي النظري: 71406.97 دالتون. النشاط النوعي : 200,000 وحدة/ملغ. شروط اختبار الوحدة: محلول تفاعل T4 RNA Ligase بتركيز 1X مُضاف إليه 10% (وزن/حجم) من بولي إيثيلين جلايكول بوزن جزيئي 8000، و20 بيكومول من الحمض النووي الريبي الموسوم بـ 5´-FAM، و40 بيكومول من رابط الحمض النووي المُسبق الأدينيل. بعد الحضانة عند 25 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، يتم الكشف عن الناتج المربوط على هلام بولي أكريلاميد مُشوه بنسبة 15%. الأسئلة الشائعة : س: الوزن الجزيئي لـ T4 Rnl2tr K227Q هو 71.6 كيلو دالتون. هل هو بروتين مُدمج؟ ج: نعم. في اختباراتنا، يعمل كل من بروتين MBP المُدمج والإنزيمات غير الموسومة بنفس الكفاءة. س: هل يمكن استخدام T4 Rnl2tr K227Q في محاليل NEBuffers أخرى؟ ج: يُلاحظ النشاط الأمثل في محلوله المنظم الخاص، ومع ذلك، يكون الإنزيم نشطًا في محلولي NEBuffer 1 و2. س: هل توجد اختلافات في كفاءة الربط بين T4 Rnl2tr وT4 Rnl2tr K227Q؟ ج: في اختبارات NEB، أظهرت عمليات الربط باستخدام T4 Rnl2tr وT4 Rnl2tr K227Q على ركائز متطابقة أن كفاءة الربط تصل إلى نفس نقاط النهاية. ومع ذلك، قد يتطلب T4 Rnl2tr K227 فترات حضانة أطول للوصول إلى نقطة نهاية التفاعل. نوصي بحضانة روابط DNA المُسبقة الأدينيل طوال الليل عند 16 درجة مئوية. س: ما الذي يمكن لـ T4 Rnl2tr K227Q ربطه؟ ج: يمكن لـ T4 Rnl2tr K227Q إجراء عمليات الربط نفسها التي يقوم بها T4 Rnl2tr (NEB #M0242). يُرجى مراجعة قسم إنزيمات ربط الحمض النووي الريبي (RNA Ligases) لمزيد من المعلومات. س: هل يُحفز البولي إيثيلين جلايكول (PEG) كفاءة الربط؟ ج: يُحفز PEG 8000 نشاط ربط T4 Rnl2tr K227Q بشكل كبير. وقد لوحظ أقصى تحفيز عند تركيز 15% (وزن/حجم) من PEG 8000. كما يُحفز PEG 4000 النشاط بتركيز مشابه لتأثير PEG 8000. س: كيف يُمكنني زيادة كفاءة الربط؟ ج: بشكل عام، تُؤدي زيادة وقت التفاعل، وخفض درجة حرارة التفاعل، وزيادة كثافة الجزيئات إلى تفاعلات ربط أكثر اكتمالًا. يُمكن زيادة أوقات التفاعل إلى 24 ساعة أو أكثر. بالنسبة لعمليات الربط التي تستغرق أكثر من ساعتين، نقوم عادةً بالحضانة عند درجة حرارة أقل من 16 درجة مئوية. وقد أفاد بعض العلماء بإجراء الربط على الجليد (0 درجة مئوية) لمدة 24 ساعة. نوصي باستخدام PEG 4000 أو 8000 بتركيز يصل إلى 15% (وزن/حجم). لم تُؤدِ زيادة تركيزات PEG إلى زيادة كفاءة الربط. س: هل PEG 8000 مُتاح للشراء؟ ج: يُضاف PEG 8000 كمكون من مكونات محلول تفاعل إنزيم ربط الحمض النووي الريبي T4 (NEB #B0216). س: ما مدى تحمل هذا الإنزيم للملح؟ ج: تحمل الملح لإنزيم ربط الحمض النووي الريبي NEB # M0204 إنزيم ربط الحمض النووي الريبي T4 1 (إنزيم ربط الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة) ≤ 50 ملي مولار، M0239 إنزيم ربط الحمض النووي الريبي T4 2 (إنزيم ربط الحمض النووي الريبي ثنائي السلسلة) ≤ 50 ملي مولار، M0242 إنزيم ربط الحمض النووي الريبي T4 2، مُختزل ≤ 100 ملي مولار، M0351 إنزيم ربط الحمض النووي الريبي T4 2، مُختزل K277Q ≤ 100 ملي مولار، M0373 إنزيم ربط الحمض النووي الريبي T4 2، مُختزل. KQ ≤ 100 ملي مولار، M0375 SplintR Ligase ≤ 50 ملي مولار، E2610 5' Adenylation Kit (Mth Ligase) ≤ 300 ملي مولار، M0319 Thermostable 5' App DNA/RNA Ligase ≤ 50 ملي مولار