مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، M0356S، بيروفوسفوهيدرولاز الحمض النووي الريبي 5' (RppH)

يقوم إنزيم بيروفوسفوهيدرولاز 5' (RppH) بإزالة البيروفوسفات من الطرف 5' لجزيء RNA ثلاثي الفوسفات، لينتج عنه جزيء RNA أحادي الفوسفات عند الطرف 5'. التصنيفات ذات الصلة: تعديل RNA، التطبيقات، استنساخ RNA، المواصفات، تعريف الوحدة: الوحدة الواحدة هي كمية الإنزيم التي تحول 1 ميكروغرام من نسخة RNA بطول 300 نيوكليوتيد إلى RNA قابل للهضم بواسطة XRN-1 خلال 30 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول NEBuffer™ 2 بتركيز 1X، يُحضن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. محلول NEBuffer™ 2 بتركيز 1X، يحتوي على: 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 10 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 1 ملي مولار DTT (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 20 ملي مولار Tris-HCl، 200 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، 0.01% Triton® X-100، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. الأسئلة الشائعة : س: هل يمكن لـ RppH أن يحل محل إنزيم بيروفوسفاتاز حمض التبغ (TAP) كإنزيم لإزالة غطاء الحمض النووي الريبوزي؟ ج: يتمثل النشاط الأساسي لـ RppH في إزالة البيروفوسفات من الطرف 5' لجزيء RNA ثلاثي الفوسفات. ومع ذلك، يمتلك RppH نشاط إزالة الغطاء أيضًا، وسيترك جزيء أحادي الفوسفات عند الطرف 5' عند حضنه مع RNA ذي غطاء. إليكم رابط بروتوكول هذا التطبيق: https://www.neb.com/protocols/2015/01/14/decapping-eukaryotic-mrna-with-rpph-neb-m0356. يوجد في أسفل البروتوكول مرجع يُبرز فعالية إنزيم RppH في إزالة غطاء الحمض النووي الريبوزي الرسول (mrna). على الرغم من أننا لم نُجرِ مقارنة مباشرة بين RppH وTAP داخليًا، فقد تلقينا ردود فعل إيجابية كبيرة من العملاء الذين استخدموا الإنزيم بدلًا من TAP. يُرجى العلم أن العملاء الذين يستخدمون بروتوكول إزالة غطاء الحمض النووي الريبوزي الرسول (mrna) سيحتاجون إلى شراء محلول Thermopol Buffer بتركيز 10X (NEB#B9004) بشكل منفصل. يُباع الإنزيم مع محلول NEBuffer 2، وهو مثالي لفعاليته في إزالة البيروفوسفات. المرجع: Hetzel J, Duttke SH, Benner C, Chory J. Nascent RNA sequencing reveals distinct features in plant transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2016؛113:12316-21. نيري ف، رابيلي س، كريبيلوفا أ، إنكارناتو د، بارلاتو س، بازيل ج، وآخرون. مثيلة الحمض النووي داخل الجين تمنع بدء النسخ الزائف. نيتشر. 2017؛543:72-7. س: هل يمكن تعطيل RppH بالحرارة؟ ج: نعم، يمكن تعطيل RppH بالحرارة عن طريق الحضانة عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ومع ذلك، لا يُنصح بالمعالجة الحرارية بسبب خطر تحلل الحمض النووي الريبي. تُفضل الطرق البديلة، مثل تنظيف الحمض النووي الريبي أو إخماد EDTA، للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. س: هل يتحمل إنزيم بيروفوسفوهيدرولاز 5' (RppH) الأملاح؟ ج: نوصي بالحفاظ على ظروف التفاعل أقل من 200 ملي مولار من الملح. س: هل من الممكن هضم الحمض النووي الريبي الخطي المقاوم لـ RNase R (NEB #M0100)؟ ج: نعم، لقد اختبرنا طريقتين لهضم الحمض النووي الريبي الخطي المقاوم لإنزيم RNase R: نوصي بإضافة وحدة واحدة من إنزيم RNase R، ووحدة واحدة من XRN-1 (NEB #M0338)، وخمس وحدات من RppH (NEB #M0356) إلى 1 ميكروغرام من عينة الحمض النووي الريبي في محلول تفاعل RNase R بتركيز 1X. يجب حضانة التفاعل لمدة 15 أو 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية لإزالة الحمض النووي الريبي الخطي بكفاءة. يُنصح بمعالجة عينات الحمض النووي الريبي مسبقًا باستخدام بوليميراز بولي (أ) من الإشريكية القولونية (NEB #M0276) لإطالة نهايات 3' للحمض النووي الريبي، مما يُحسّن ارتباط إنزيم RNase R ونشاطه. يجب تنقية الحمض النووي الريبي قبل البدء بتفاعل RNase R.