نيو إنجلاند بيولابس، M0366L، ناقل ميثيل غطاء mRNA 2'-O

يُضيف إنزيم ناقل ميثيل 2'-O لغطاء mRNA مجموعة ميثيل عند الموضع 2'-O لأول نيوكليوتيد مجاور لبنية الغطاء عند الطرف 5' من الحمض النووي الريبي. التصنيفات ذات الصلة : مواصفات غطاء الحمض النووي الريبي، تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لمثيلة 10 بيكومولات من نسخة الحمض النووي الريبي المغطاة بطول 80 نيوكليوتيد في ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول التغطية 1X، يُضاف إليه 0.2 ملي مول من S-أدينوسيل ميثيونين (SAM)، ويُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول التغطية 1X: 50 ملي مول من Tris-HCl، 5 ملي مول من KCl، 1 ملي مول من MgCl2، 1 ملي مول من DTT (الأس الهيدروجيني 8 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين : 20 ملي مول من Tris-HCl، 100 ملي مول من NaCl، 1 ملي مول من DTT، 0.1 ملي مول من EDTA، 50% جلسرين، 0.1% (وزن/حجم) Triton® X-100، الأس الهيدروجيني 8 عند 25 درجة مئوية. الأسئلة الشائعة : س: ما نوع الحمض النووي الريبوزي (RNA) الذي يمكن مثيلته باستخدام إنزيم mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase؟ ج: يتطلب إنزيم mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase حمضًا نوويًا ريبوزيًا مغطى كركيزة. يمكن تحضير الحمض النووي الريبوزي المُغطى (capped RNA) عن طريق النسخ المختبري (مجموعة T7 لتخليق الحمض النووي الريبوزي عالي الإنتاجية، NEB# E2040) باستخدام نظير الغطاء (ARCA 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog، NEB# S1411) أو عن طريق التغطية الأنزيمية باستخدام إنزيم التغطية الخاص بفيروس الوقس (NEB# M2080). س: أرغب في استخدام إنزيم mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase مع نظام التغطية الخاص بفيروس الوقس (NEB# M2080) في تفاعل من خطوة واحدة لإنتاج الحمض النووي الريبوزي المُغطى (cap 1 RNA). هل هذا ممكن؟ ج: نعم، يمكن استخدام إنزيم mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase في نفس الوقت مع إنزيم التغطية الخاص بفيروس الوقس في تفاعل من خطوة واحدة. يتضمن ذلك تغطية الحمض النووي الريبوزي ومثيلته في نفس التفاعل. يُضيف إنزيم التغطية الخاص بفيروس الوقس غطاء m7G إلى الطرف 5' من الحمض النووي الريبي (RNA) لإنتاج حمض نووي ريبي مُغطى. يستخدم إنزيم 2'-O-ميثيل ترانسفيراز هذا الحمض النووي الريبي كركيزة، ويُضيف مجموعة ميثيل إلى الموضع 2'-O لأول نيوكليوتيد مُستنسخ لإنتاج حمض نووي ريبي مُغطى من النوع 1. راجع قسم البروتوكول لإعداد التفاعل. س: ما هي الاحتياطات الواجب اتخاذها عند استخدام إنزيم 2'-O-ميثيل ترانسفيراز الخاص بغطاء الحمض النووي الريبي الرسول (mRNA)؟ ج: من المهم التأكد من خلو الحمض النووي الريبي المستخدم في التفاعل من الأملاح و EDTA. يُفضل إعادة تعليقه في ماء خالٍ من النيوكلياز. نوصي بشدة باستخدام القفازات والأنابيب ورؤوس الماصات والكواشف الخالية من النيوكلياز لمنع تلوثها بالريبونوكلياز. يمكن استخدام مثبط الريبونوكلياز (NEB# M0314) في التفاعل لمنع التحلل الناتج عن الريبونوكليازات الملوثة. س: ما هو غطاء 0 وغطاء 1؟ ج: Cap-0 هو غوانوزين N7-ميثيل مرتبط بالنيوكليوتيد 5′ برابطة ثلاثية الفوسفات 5′-5′، ويُشار إليه عادةً في المراجع العلمية باسم m7G cap أو m7Gppp-. في الخلية، يُعد تركيب Cap-0 ضروريًا لترجمة mRNA الحامل للغطاء بكفاءة. يؤدي مثيلة إضافية على الموضع 2′O للنيوكليوتيد البادئ إلى تكوين Cap-1، أو يُشار إليه باسم m7GpppNm-، حيث يشير Nm إلى أي نيوكليوتيد يحتوي على مثيلة 2′O. وقد ثبتت أهمية Cap-1 في التهرب من الاستجابة المناعية الفطرية الخلوية في الجسم الحي. س: هل يمكن استخدام نظائر الغطاء في تفاعل الغطاء مع إنزيم Vaccinia Capping Enzyme (NEB #M2080)؟ ج: لا. يستخدم إنزيم Vaccinia Capping Enzyme كلاً من GTP وSAM لتكوين تركيب الغطاء على RNA ثلاثي الفوسفات 5′، وهو عادةً نسخة اصطناعية مُولَّدة عن طريق النسخ في المختبر. من ناحية أخرى، يتم استخدام نظائر الغطاء، مثل GpppG (NEB #S1407)، وm7GpppG (NEB #S1404)، وm7GpppA (NEB #S1405S) ونظير الغطاء العكسي المضاد (ARCA؛ NEB #S1411) أثناء النسخ في المختبر، حيث يتم دمج نظير الغطاء مباشرة في النسخة كأول نيوكليوتيد في النهاية 5′.