نيو إنجلاند بيولابس، M0367S، مزيج رئيسي من إنزيمات الربط Blunt/TA

مزيج الربط الرئيسي Blunt/TA Ligase يقوم بربط هذه الركائز: الفئات ذات الصلة : إنزيمات ربط الحمض النووي، التطبيقات: الاستنساخ، مواصفات الربط: التعطيل الحراري، لا توجد أسئلة شائعة . س: لم تُنتج تفاعلات التحويل باستخدام مزيج الربط الرئيسي Blunt/TA Ligase أي مستعمرات. ما السبب؟ ج: غالبًا لا يشير عدم ظهور المستعمرات بعد التحويل إلى فشل عملية الربط. تختلف الخلايا المؤهلة اختلافًا كبيرًا في كفاءتها. يمكن أن يُحدث استخدام خلايا مؤهلة عالية الكفاءة فرقًا كبيرًا في نجاح عملية الربط. كما أن سلامة الحمض النووي المستخدم يمكن أن تؤثر بشكل كبير على النتيجة. على سبيل المثال، يمكن لكمية ضئيلة من الإكسونوكلياز الموجودة في عينة الحمض النووي قبل الربط أن تُزيل الطرف البارز وتمنع ربط النهايات المتوافقة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للأملاح المتبقية من خطوات التنقية أن تُثبط أو تُقلل من كفاءة الربط. يجب أن تكون نهايات الحمض النووي المراد ربطها متوافقة مع شريك واحد على الأقل يحتوي على مجموعة فوسفات 5'. يحتاج الحمض النووي الناتج من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) إلى استخدام بادئات مُفسفرة أثناء التخليق أو معالجته بإنزيم كيناز بعد التخليق. يحافظ الحمض النووي المُحضر بواسطة هضم إنزيمات التقييد على فسفرة الطرف 5'. يمكن ربط الأطراف غير المتداخلة بأي أطراف غير متداخلة أخرى، بينما تحتاج القطع ذات النهايات البارزة إلى اقتران القواعد بشكل صحيح ليتم ربطها. س: هل يمكن استخدام مزيج الربط الرئيسي للأطراف غير المتداخلة/TA لربط القطع ذات النهايات اللاصقة؟ ج: نعم. تم تحسين مزيج الربط الرئيسي للأطراف غير المتداخلة/TA لربط القطع ذات النهايات غير المتداخلة والقطع ذات القاعدة الواحدة البارزة. كما يمكن إنجاز ربط القطع ذات النهايات اللاصقة، وهو تفاعل يتم بكفاءة أعلى، باستخدام هذا المنتج. يُحسّن مزيج الربط الرئيسي للأطراف التي تتفاعل عادةً ببطء. عوائد منتج الربط النهائي لجميع ظروف التفاعل باستخدام تركيز عالٍ من إنزيم T4 DNA Ligase (NEB #M0202)، ومجموعة الربط السريع (NEB #M2200)، ومزيج الربط الرئيسي للأطراف غير المتداخلة/TA (NEB #M0367). تمت حضانة ركائز نيك، والنهاية المتماسكة، والركيزة ذات القاعدة المفردة المتدلية بطول 3 أقدام لمدة 15 دقيقة؛ بينما تمت حضانة الركيزة ذات القاعدة المفردة المتدلية بطول 5 أقدام لمدة ساعة واحدة. س: هل يمكن استخدام تفاعل الربط الناتج عن مزيج الربط الرئيسي Blunt/TA Ligase مباشرةً لتحويل الخلايا المؤهلة كهربائيًا؟ ج: لا. لا نوصي باستخدام تفاعلات الربط التي تحتوي على مزيج الربط الرئيسي Blunt/TA Ligase لتحويل الخلايا المؤهلة كهربائيًا. يجب تنقية الحمض النووي قبل استخدامه في عملية التحويل الكهربائي. س: الحجم الموصى به لتفاعل مزيج الربط الرئيسي Blunt/TA Ligase هو 10 ميكرولتر. أرغب في إجراء تفاعلات الربط بحجم 20 ميكرولتر. هل يمكنني زيادة حجم التفاعل؟ ج: نعم. طالما أن تركيز مزيج الربط الرئيسي Blunt/TA Ligase في التفاعل هو 1X (أو 50% من إجمالي حجم التفاعل)، يمكنك زيادة حجم تفاعل الربط. س: أستخدم عادةً أكثر من 5 ميكرولتر من تفاعلات الربط لتحويل 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. عند استخدام مزيج الربط الرئيسي Blunt/TA Ligase Master Mix، أحصل على عدد قليل جدًا من المستعمرات في أطباق التحويل. ما المشكلة برأيك؟ ج: لا نوصي باستخدام أكثر من 5 ميكرولتر من تفاعلات الربط باستخدام مزيج الربط الرئيسي Blunt/TA Ligase Master Mix لتحويل 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. في بعض الحالات، لاحظنا انخفاضًا في كفاءة التحويل عند استخدام أكثر من 5 ميكرولتر من هذا المزيج. يجب ربط الحمض النووي ذي النهايات المتوافقة والسليمة والموجودة بالكميات المحددة في البروتوكول باستخدام مزيج الربط الرئيسي Blunt/TA Ligase Master Mix. ليس من الضروري استخدام أكثر من 5 ميكرولتر في تفاعل التحويل القياسي. س: هل يمكنني حضانة تفاعل الربط باستخدام مزيج الربط الرئيسي Blunt/TA Ligase Master Mix لأكثر من 15 دقيقة؟ ج: نعم. مع ذلك، أظهرت اختباراتنا أن فترات الحضانة الأطول لا تُنتج المزيد من الخلايا المحولة. يرجى ملاحظة أننا لا نوصي بحضانة المزيج طوال الليل، لأن تحويلات الربط التي تُحضن طوال الليل تؤدي إلى انخفاض كبير في عدد الخلايا المتحولة. س: هل يمكنني حضانة تفاعل ربط Blunt/TA Ligase Master Mix عند درجة حرارة أخرى غير 25 درجة مئوية؟ ج: نعم. يمكنك حضانة التفاعلات عند 16 درجة مئوية أو 4 درجات مئوية. س: تجمد مزيج Blunt/TA Ligase Master Mix الخاص بي في المجمد. هل هذه مشكلة؟ ج: لا. لقد اختبرنا ثبات المنتج بعد التجميد. وقد أكد اختبار الذوبان الحر أن الأداء بعد 20 دورة تجميد/ذوبان قريب من أداء المزيج السائل الأصلي. إذا تجمد المنتج في المجمد، فمن المحتمل أن تكون درجة الحرارة الداخلية أقل من -20 درجة مئوية المتوقعة. س: يشير بروتوكول Blunt/TA Ligase Master Mix إلى أنه لا ينبغي تعطيل التفاعل بالحرارة. كيف يمكنني تعطيل نشاط الربط؟ ج: عادةً لا توجد حاجة لتعطيل تفاعلات ربط Blunt/TA. يمكن استخدام هذا التفاعل مباشرةً لتحويل الخلايا المؤهلة كيميائيًا، أو يمكن تنقية الحمض النووي عن طريق الترسيب بالإيثانول، أو التنقية بالهلام، أو باستخدام أي عمود أو خرز مناسب لتنقية الحمض النووي لفصل ناتج الربط عن نشاط الإنزيم ومكونات التفاعل الأخرى. إذا رغبتَ في إيقاف التفاعل دون تنقية، يمكنك إضافة حجم مماثل من محلول EDTA بتركيز 50 ملي مولار وخلطه باستخدام الماصة، إلا أن ذلك سيؤثر على التفاعلات اللاحقة التي تتطلب المغنيسيوم أو كاتيونات ثنائية التكافؤ أخرى.