نيو إنجلاند بيولابس، M0368X، بروتوسكريبت® II إنزيم النسخ العكسي

الفئات ذات الصلة: RT-PCR، وتخليق cDNA، وتطبيقات النسخ العكسي، والتضخيم المعتمد على الهيليكاز، وتخليق cDNA، والنسخ العكسي (تخليق cDNA)، وتعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي ستدمج 1 نانومول من dTTP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر في 10 دقائق عند 37 درجة مئوية باستخدام poly(rA)•oligo(dT) 18 كقالب. شروط التفاعل: محلول تفاعل النسخ العكسي ProtoScript® II بتركيز 1X، يُحضن عند درجة حرارة 42 درجة مئوية. محلول تفاعل النسخ العكسي ProtoScript® II بتركيز 1X: 50 ملي مولار Tris-HCl، 75 ملي مولار KCl، 3 ملي مولار MgCl2 (الأس الهيدروجيني 8.3 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 20 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار NaCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، 0.01% IGEPAL® CA-630، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. شروط فحص الوحدة : 50 ملي مولار Tris-HCl (الأس الهيدروجيني 8.3)، 75 ملي مولار KCl، 6 ملي مولار MgCl2، 10 ملي مولار دايثيوثريتول، 0.01% IGEPAL CA-630. 0.5 ملي مولار من dTTP، 0.4 ملي مولار من متعدد (rA)•أوليجو (dT) 18. الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين NEB# M0368 وNEB# M0253؟ ج: M0368 هو إنزيم نسخ عكسي متحور من M-MuLV ذو نشاط RNase H منخفض وثبات حراري متزايد. يعمل الإنزيم حتى 50 درجة مئوية، مما يوفر خصوصية أعلى، وإنتاجية أعلى من cDNA، ومنتج cDNA كامل الطول. س: ما هي درجة حرارة التفاعل المثلى لإنزيم النسخ العكسي ProtoScript II (M0368)؟ ج: إنزيم النسخ العكسي ProtoScript II قادر على توليد cDNA يزيد طوله عن 10 كيلوبايت حتى 48 درجة مئوية. نوصي بـ 42 درجة مئوية للنسخ العكسي الروتيني. س: هل يمكن استخدام منتجات cDNA في تحليل PCR في الوقت الحقيقي؟ ج: نعم. يمكن استخدام منتجات الحمض النووي التكميلي (cDNA) الناتجة عن إنزيم النسخ العكسي ProtoScript II مباشرةً في تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR). س: ما هو إنزيم بوليميراز الحمض النووي المقاوم للحرارة الذي يمكن استخدامه في تفاعل البوليميراز المتسلسل بعد تخليق الحمض النووي التكميلي؟ ج: لتفاعل البوليميراز المتسلسل اللاحق، نوصي باستخدام OneTaq 2X Master Mix (NEB #M0482 أو M0485) للكشف عن الحمض النووي التكميلي حتى 5 كيلوبايت، أو Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (NEB #M0494) للحصول على أعلى دقة، أو LongAmp Taq 2X Master Mix (NEB #M0287) للحصول على كميات كبيرة من المنتجات الأطول. س: كيف يمكن تحسين الكمية الناتجة عند استخدام إنزيم النسخ العكسي ProtoScript II؟ ج: يمكنك استخدام كمية أكبر من الإنزيم تصل إلى 1000 وحدة لكل 20 ميكرولتر من تفاعل تخليق الحمض النووي التكميلي، وزيادة تركيز النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTP) حتى 1 ملي مولار. س: كيف يمكن زيادة طول المنتج الناتج عن إنزيم النسخ العكسي M-MuLV؟ ج: يمكن أن يؤدي التحضين عند درجة حرارة 42 درجة مئوية إلى إرخاء بعض البنية الثانوية للحمض النووي الريبي (RNA)، مما يسمح لإنزيم النسخ العكسي M-MuLV بإنتاج نواتج أطول. س: هل المعالجة بإنزيم RNaseH ضرورية قبل تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؟ ج: بالنسبة لمعظم تفاعلات RT-PCR، لا تتطلب المعالجة بإنزيم RNaseH. ولكن بالنسبة لبعض النواتج المضخمة الصعبة أو الاختبارات الحساسة، أضف وحدتين من إنزيم RNaseH من الإشريكية القولونية إلى التفاعل، ثم حضّنه عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. س: ما الفرق بين إنزيم النسخ العكسي Induro (NEB #M0681) وإنزيم النسخ العكسي ProtoScript II (NEB #M0368)؟ ج: يوجد نوعان رئيسيان من إنزيمات النسخ العكسي (RT): إنزيمات النسخ العكسي المشفرة بواسطة الفيروسات القهقرية، وإنزيمات النسخ العكسي المشفرة بواسطة الإنترونات. يشترك كلا النوعين في بعض المجالات المحفوظة، ويقومان بتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من قالب الحمض النووي الريبي (RNA). تُشتق أكثر إنزيمات النسخ العكسي شيوعًا ودراسةً من الفيروسات القهقرية، مثل فيروس لوكيميا الفئران مولوني (M-MuLV، MMLV)، مثل إنزيم النسخ العكسي ProtoScript II. في المقابل، يُعد إنزيم النسخ العكسي Induro من المجموعة الثانية، وهو إنزيم نسخ عكسي مُشفّر بواسطة إنترون، ويتميز بثبات حراري أعلى، وسرعة معالجة أكبر، وتحمل أفضل لمكونات التفاعل مقارنةً بإنزيمات النسخ العكسي الفيروسية القهقرية. يُستخدم إنزيم النسخ العكسي Induro في تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من النسخ الطويلة، والحمض النووي الريبوزي (RNA) ذي البنية الثانوية القوية، وعينات الحمض النووي الريبوزي التي تحتوي على مثبطات. س: لماذا أحصل على كميات قليلة من الحمض النووي التكميلي (cDNA)؟ ج: هناك عدة أسباب لانخفاض كمية الحمض النووي التكميلي (cDNA). إليك بعض الاقتراحات لتحسين الكمية: تحقق من سلامة الحمض النووي الريبوزي (RNA) عن طريق الفصل الكهربائي على هلام الأغاروز المُشوه أو باستخدام جهاز BioAnalyzer (Agilent). يُعد الحمض النووي الريبوزي (RNA) السليم عالي النقاء ضروريًا لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) كامل الطول. يجب أن يكون للحمض النووي الريبوزي (RNA) نسبة امتصاص عند 260 نانومتر إلى امتصاص عند 280 نانومتر لا تقل عن 1.7 أو رقم RIN أكبر من 8. يمكن إزالة الملوثات مثل EDTA والجوانيدينيوم عن طريق الترسيب بالإيثانول متبوعًا بغسل بالإيثانول بنسبة 70%. كما يمكن إزالة السكريات المتعددة عن طريق الترسيب بكلوريد الليثيوم. ويمكن إزالة البروتينات الملوثة مثل البروتيازات من خلال خطوة تنقية الحمض النووي الريبوزي باستخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي الريبوزي أو الاستخلاص بالفينول/الكلوروفورم. يُنصح بزيادة كمية الحمض النووي الريبوزي المستخدم، خاصةً للحمض النووي الريبوزي منخفض الوفرة. س: كيف أعرف ما إذا كان الحمض النووي الريبوزي القالب ذو جودة جيدة؟ ج: يُعد الحمض النووي الريبوزي السليم عالي النقاء ضروريًا لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) كامل الطول. تشير نسبة الامتصاص عند 260 نانومتر إلى امتصاص عند 280 نانومتر أعلى من 1.7 أو رقم RIN أكبر من 8 على جهاز BioAnalyzer عادةً إلى جودة عالية للحمض النووي الريبوزي.