نيو إنجلاند بيولابس، M0369S، إلكتروليغاز®

فئات ذات صلة بإنزيم ElectroLigase: تطبيقات إنزيمات ربط الحمض النووي، الاستنساخ، مواصفات الربط، التعطيل الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. الأسئلة الشائعة : س: لم تُنتج تفاعلات ElectroLigase® أي مستعمرات. ما السبب؟ ج: غالبًا لا يُشير عدم ظهور المستعمرات بعد التحويل إلى فشل عملية الربط. تختلف الخلايا المؤهلة اختلافًا كبيرًا في كفاءتها. يُمكن أن يُحدث استخدام خلايا مؤهلة عالية الكفاءة فرقًا كبيرًا في نجاح عملية الربط. كما أن سلامة الحمض النووي المستخدم تُؤثر بشكل كبير على النتيجة. على سبيل المثال، يُمكن أن تُؤدي كمية ضئيلة من الإكسونوكلياز الموجودة في عينة الحمض النووي قبل الربط إلى إزالة الطرف البارز ومنع ربط النهايات المتوافقة. بالإضافة إلى ذلك، يُمكن أن تُثبط الأملاح المتبقية من خطوات التنقية كفاءة الربط أو تُقللها. تشمل العوامل الأخرى التي تُؤثر على التحويل شرط أن تكون نهايات الحمض النووي المراد ربطها متوافقة مع شريك واحد على الأقل يحتوي على مجموعة فوسفات في الطرف 5'. يحتاج الحمض النووي المُنتج من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) إلى استخدام بادئات مُفسفرة أثناء التخليق أو معالجته بإنزيم كيناز بعد التخليق. يحافظ الحمض النووي المُحضر بواسطة هضم إنزيمات التقييد على فسفرة الطرف 5'. يمكن ربط الأطراف غير المتداخلة بأي أطراف غير متداخلة أخرى، بينما تحتاج القطع ذات النهايات البارزة إلى اقتران القواعد بشكل صحيح ليتم ربطها. س: هل يمكن استخدام تفاعلات الربط المُجهزة باستخدام ElectroLigase® لتحويل الخلايا المؤهلة كيميائيًا؟ ج: نعم، لا تحتوي تفاعلات ElectroLigase® على أي شيء يمنع تحويل الخلايا المؤهلة كيميائيًا. في الواقع، تعمل بشكل جيد جدًا، حيث تقترب كفاءتها من 50% من كفاءة مزيج Blunt/TA Ligase Master Mix الخاص بنا في التحليلات المقارنة. س: هل أحتاج إلى تخفيف تفاعل ElectroLigase® لاستخدامه في تحويل الخلايا المؤهلة كهربائيًا؟ ج: لا، يمكن استخدام تفاعلات ElectroLigase®، دون تخفيف، في إجراءات التثقيب الكهربائي. س: هل يمكن حضانة تفاعلات ElectroLigase® لأكثر من 30 دقيقة؟ ج: نعم، مع ذلك، أظهرت اختباراتنا أن معظم التفاعلات تكتمل تقريبًا في غضون 30 دقيقة، مع ملاحظة بعض الفائدة في ربط النهايات غير المتداخلة عند تمديد المدة إلى 60 دقيقة. يُرجى ملاحظة أننا لا نوصي بالحضانة طوال الليل لأن تحويلات الربط المحضونة طوال الليل مع ElectroLigase® تُنتج عمومًا عددًا أقل من الخلايا المُحوَّلة. س: هل يُمكنني حضانة تفاعل ربط ElectroLigase® عند درجة حرارة أخرى غير 25 درجة مئوية؟ ج: نعم، لوحظ ربط فعال عند درجات حرارة اختبار 4 درجات مئوية، و16 درجة مئوية، و25 درجة مئوية، و37 درجة مئوية. ولتوفير الراحة مع الحفاظ على الأداء العالي، نوصي بدرجة حرارة حضانة 25 درجة مئوية. س: استخدمتُ تفاعل ElectroLigase® لتحويل الخلايا المؤهلة كهربائيًا، ولاحظتُ حدوث شرارة كهربائية في العينة. ما الذي حدث؟ ج: صُممت تفاعلات ElectroLigase لتكون متوافقة تمامًا مع الخلايا المؤهلة كهربائيًا. لم تُظهر الاختبارات على العديد من العينات أي مشكلة باستخدام ظروف التثقيب الكهربائي المعتادة. قد يحدث تقوس كهربائي أثناء عملية التثقيب الكهربائي نتيجة لانخفاض المقاومة أو ارتفاع الموصلية في العينة. من العوامل الرئيسية المؤثرة على الموصلية أثناء هذه العملية درجة حرارة العينة وتركيز الأملاح. يجب حفظ الخلايا المؤهلة باردة على الثلج، مع الحرص على عدم تسخين الكوفيت المستخدم قبل تعريضه للمجال الكهربائي. لذا، يُنصح بارتداء قفازات ومسح الكوفيت بمنديل ورقي فقط عند الضرورة، مع الحرص على عدم تسخين العينة. يجب أن يكون الحمض النووي المستخدم في عمليات الربط باستخدام إنزيم ElectroLigase نقيًا (مثلًا، مُنقى باستخدام عمود كروماتوغرافي) ومعلقًا في محلول مائي ذي قوة أيونية منخفضة (10 ملي مولار من محلول Tris أو أقل مناسب). أخيرًا، قد تمنع فقاعات الهواء المحتبسة في العينة تلامسها مع قطبي الكوفيت. يمكن التخلص من الهواء المحتبس ببضع نقرات خفيفة على الكوفيت على سطح مستوٍ بعد وضع خليط الحمض النووي/الخلايا المؤهلة.